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              深度好文!人類癌癥與免疫治療發展史


              癌癥是典型的多細胞增殖失控性疾病。一般認為,地球生命在6億年前出現多細胞生命,現存的海綿類多孔動物門是最早出現的多細胞動物。人類的疾病多少與先天發育不足有關,另外一些與后天的損傷有關。人體內的主要系統只有2種:代謝和免疫,所有的疾病不外此2種。


              1億年前,鼠與人類的共同祖先出現。



              人與人之間的基因組相似度在99.99%。我們血緣關系最近的親屬——黑猩猩,在基因上與我們人類的相似度達到了96%。人類和獼猴共有93%的DNA。貓的基因與我們人類有著90%的相似性。


              當涉及到蛋白編碼基因時,老鼠與我們有著85%的相似度,但是在非編碼基因上,只有大約50%的相似度。國家人類基因研究所把這種相似性歸咎于大約8千萬年前的共同祖先。幾乎所有的人類基因在老鼠身上都有個明確的對應基因,但是蛋白質編碼基因只占據了各自基因組的1.5%,基于此,能治愈老鼠的化合藥物通常對人類無效。


              2009年《科學》雜志上的一篇報道,家牛與我們人類共享大約80%的基因。雞與人類共享了大約60%的基因。果蠅與人類共享了61%的致病基因,這對于美國宇航局探索太空旅行可能對人類基因產生的影響非常重要。香蕉也與人類共享了大約60%的基因。


              目錄


              一、免疫發展史

              二、免疫學原理

              三、主要抗癌免疫療法

              四、免疫狀態評估

              五、免疫治療毒性和療效評估

              六、ICIs耐藥現象的解釋

              七、臨床應用



              一、免疫治療簡史


              免疫系統是多細胞動物特化的一個系統,用以維持多細胞動物在細胞層面和分子層面的穩定性。在單細胞動物中存在的原始基本機制是多細胞化后復雜機制的基礎,類如在單細胞動物中的分子系統CRISPR-cas系統就是一個維護單細胞穩定性的免疫機制。



              1909年Paul Ehrlich提出免疫監視學說,認為免疫系統可以遏制腫瘤的發生,免疫功能異常是腫瘤發生的基本原因之一。


              1959年Frank Macfarlane Burnet和Lewis Thomas(曾任MSK院長)提出了“免疫監視(tumor immune surveillance)”的假說,該假說認為免疫系統能夠識別并清除惡性腫瘤,從而抑制了腫瘤的發生發展。


              2002年Gavin P Dunn和RobertD Schreiber等首次提出了腫瘤免疫編輯(Tumor Immunoediting)學說,系統闡述了癌癥和免疫系統之間的三階段關系。



              二、抗癌免疫學的基本原理


              100余年人類對免疫系統的不懈研究,目前已經對該領域的主要問題有了一些粗淺的認識。陳列平教授將人類對抗癌免疫的認識過程總結為,三大基本問題:有沒有?免疫原性的狀態如何?啟動抗癌免疫的相關因素。即:


              (一)人類機體內是否存在清除癌細胞的免疫反應?


              答案是肯定的!


              1868年一位叫威廉.布什(WilhelmBusch)的醫生第一次報道,有意使用丹毒感染癌癥病人后腫瘤顯著縮小。1891年,美國紐約紀念醫院骨科醫師威廉.科利(WilliamB.Coley,1862~1936)開始以注射細菌進入腫瘤的方法治療癌癥,創立“科利毒素”療法。這種方法療效并不穩定,而且可能死于感染;改進后混合加熱過的細菌液變得安全,經這種方法確實有不少人惡性腫瘤在無藥可醫的情況下得到了緩解,甚至是長期緩解。曾經一睹被打壓的早期免疫治療探索今天已經得到世人的認可,并以其名字命名了免疫界最高獎項為威廉.科利獎。


              如細胞因子療法、過繼免疫細胞療法及免疫檢查點抑制劑療法的效果已經被證實,其中有廣泛意義的是ICIs,在多數癌種均有一定比例的患者獲得療效,和既往的化療及分子靶向治療的機理完全不同。


              (二)是否存在特異性的抗原以引發清除癌細胞的特異性免疫反應?


              癌細胞來源與人體自身細胞,存在抗原,但是經歷了免疫編輯后的癌細胞抗原性較弱,難以有效激發免疫反應。而且在腫瘤微環境局部存在復雜的免疫抑制或免疫逃逸,導致免疫反應不能有效完成。


              抗原是激發免疫反應的起點,未來這個問題尚需要繼續充分研究。比利時的Thierry Boon教授長期研究癌細胞抗原問題。對于一個已經進入臨床階段并進展的癌癥病灶(原位持續增殖或者可轉移的),有沒有癌細胞獨有的抗原?進展狀態的病灶存不存在人體細胞在任何時期都沒有表達過的抗原性質(免疫原性)的物質?


              目前看癌癥抗原領域有如下觀點:

              癌細胞存在獨有的抗原嗎?還是共享的?例如有些CEA/AFP是人類胎兒時期的蛋白質,且功能現在也不清楚。癌變后,這些本來應該沉沒的基因重新激活并大量表達。不知道癌細胞是紊亂表達還是功能性表達。存在癌細胞專有表達的基因嗎?目前看是有的,很少,要么表達少,要么已經被免疫掉,要么免疫原性不足。


              比利時學者Thierry Boon長期研究抗癌免疫反應的核心問題癌癥抗原,他說癌細胞的抗原性才是主要問題??乖圆蛔闶钱斍癟ME免疫抑制/逃逸的解除只能解決部分問題的一個重要原因。



              BOX:癌癥抗原問題:沒有抗原性就沒有免疫反應


              抗原本身的因素 

              異物性

              抗原與機體的種系關系越遠,其差異越大,免疫原性也就越強。

              1)異種間的物質:病原微生物、動物免疫血清對人是良好抗原。

              2)同種異體間的物質:人紅細胞表面ABO血型抗原系統及同種異體皮膚和器官上的組織相容性抗原。

              3)自身抗原:自身物質一般無抗原性。

              a:與淋巴細胞從未接觸過的自身物質(如晶狀體蛋白)

              b:自身物質理化性狀發生改變(外傷、感染、藥物、電離輻射等)


              理化性狀

              1)分子大小 

              一般說來分子量越大,抗原性越強。具有抗原性的物質,分子量一般在10.0kD以上,個別超過100.0kD,低于4.0kD者一般不具有抗原性。

              2)化學結構的復雜性,

              蛋白質,芳香族氨基酸為主者,尤其是含酪氨酸的蛋白質,抗原性強,非芳香族氨基酸為主者,抗原性較弱。

              3)分子構象和易接近性

              4)物理狀態,

              一般聚合狀態的蛋白質較其單體免疫原性強,顆粒性抗原強于可溶性抗原。


              免疫途徑和抗原劑量

              具備上述條件的抗原物質可因進入機體的途徑和劑量的不同而免疫效果迥異。

              人工免疫時,多數抗原是非經口進入(皮內、皮下、肌肉、靜脈、腹腔注射)機體才具有抗原性。


              機體方面的有關因素 

              1)宿主與抗原來源的種系進化關系

              2)宿主的遺傳背景

              3)機體的健康和營養狀況

              以上幾方面因素在一定程度上是相互制約的。


              (三)如何激發抗癌免疫反應?


              激發免疫反應涉及到很多復雜的方面,如果有時間精力也可以做一個像Daniel Chen的框架圖,就現狀而言,我們仍處在暗室之中,只是偶爾發現了幾個分子開關,更加復雜的網絡還沒有被發現。


              荷蘭Christian U Blank在科學雜志撰文描述了影響抗癌免疫反應的7大因素,并用雷達圖描繪出來。大概可分類為幾類:


              ① 癌細胞本身的:如有氧酵解水平的LDH,細胞膜表面的抗原負荷、MHC表達,負反饋作用的PD-L1表達。

              ② 血液中的:CRP、IL-6所反應的慢性炎癥水平;這些標志物反映了人體內有不能清除的抗原異物。一如生理性自身免疫反應在于清除體內衰老的廢物代謝物一樣,使用的是IgM快速清除機制,而如果是病理性自身免疫反應就需要動用慢性炎癥反應機制,IgG系統。還有一個是循環血液中的免疫細胞數,這個反應了宿主的免疫系統狀態。

              ③微環境中的:TME中的TIL反應了免疫細胞是否能夠進入最后階段,這一階段停止于局部的免疫抑制或免疫逃逸。


              值得注意的是Blank沒有討論微生態在抗癌免疫中的價值,或許是缺乏可檢測標準吧。微生態是一個重要的方向,科學雜志的癌癥免疫治療專輯曾專門發文討論。


              三、主要抗癌免疫療法


              抗癌免疫療法的歷史悠久,最早是1868年一位叫威廉.布什(Wilhelm Busch)的醫生第一次報道,有意使用丹毒感染癌癥病人后腫瘤顯著縮小。丹毒(erysipelas)是一種累及真皮淺層淋巴管的感染,主要致病菌為A組β溶血性鏈球菌。誘發因素為手術傷口或鼻孔、外耳道、耳垂下方、肛門、陰莖和趾間的裂隙。


              1891年,美國紐約紀念醫院骨科醫師威廉.科利(William B.Coley,1862~1936)開始以注射細菌進入腫瘤的方法治療癌癥,創立“科利毒素”療法。這種方法療效并不穩定,而且可能死于感染;改進后混合加熱過的細菌液變得安全,經這種方法確實有不少人惡性腫瘤在無藥可醫的情況下得到了緩解,甚至是長期緩解。由于20世紀初更加安全有效的放射療法已經開始普及,科利毒素療法開始被MSK醫院禁止,直至后來被ASCO禁止,雖然ASCO最終撤銷了禁令。后來科利的女兒繼承了父親的遺志,曾出巨資資助癌癥免疫治療研究。曾經一睹被打壓的早期免疫治療探索今天已經得到世人的認可,并以其名字命名了免疫界最高獎項為威廉.科利獎。


              根據已知的免疫學原理,推測這種利用細菌感染治療癌癥的機制是以細菌抗原調高機體對腫瘤的反應性,是先天免疫和后天免疫均處于激活狀態。細菌和自身衰老損傷細胞即癌變細胞均為同一種免疫機制清除,之間并無嚴格的界限,甚至有相當部分功能處于重疊狀態。


              然而由于人類對自身小宇宙中的這個神秘系統認知的局限性,很長時間以來人類并沒有找到可靠的免疫治療方法。直到兩種免疫治療手段出現:



              1. 針對癌細胞的抗體治療

              癌細胞上有一些特殊的抗原,人類使用免疫學抗體原理清除他們以達到治療癌癥的目的,這些治療取得了一定療效。


              赫賽汀單抗:針對癌細胞的生長刺激因子,即人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)。該基因,即c-erbB-2基因,定位于染色體17q12-21.32上,編碼相對分子質量為185000的跨膜受體樣蛋白,具有酪氨酸激酶活性。這個受體被阻滯后,癌細胞的生長轉移特性受到抑制。但是由于癌細胞不止一種生長刺激因子,所以即使癌細胞初始表達這種受體,但是初始僅有50%左右的病人對這種治療有效,幾乎所有病人會在一年內對該抗體治療耐藥。



              2. 細胞間質如血管是癌癥病灶必須的,針對癌癥病灶中的細胞間質治療。

              AVASTIN(貝伐單抗):針對VEGF這種細胞因子的抗體,可以引發抗體反應清除這種細胞因子,阻斷體內新生血管的形成來阻滯癌癥的進展,代價是人體正常的血管新生的生理過程也受到干擾。


              3. 免疫檢測點抑制劑(ICIs)



              免疫檢測點是指位于效應T細胞上的一些激活性和抑制性受體調節開關,使用激活性抗體可以啟動該受體下游的功能(激活或者抑制),激活可以使得T細胞處于攻擊狀態,抑制可以使得T細胞處于安靜狀態。人體內有100萬億個種類各異的真核細胞,如何精準地調節T細胞的免疫攻擊性能是一個受到多種機制調節的過程,其中免疫檢測點是其中的一種調節機制。


              第一個被應用于醫療實踐的免疫檢測點是CTLA-4,由美國學者James Allison發現并花了10年左右證實其功能。第二個被發現的該類分子是PD1/PD-L1,PD1首先被日本學者本庶佑發現,并被證實其效用;而PD-L1是被美籍華人學者陳列平發現的,后也被證實其效用。


              當前的主要ICIs就是基于這幾個靶點設計的。免疫檢測點由很多,其它分子也有潛在的開發價值,相關藥物正在研發中。


              4. 過繼細胞療法CAR-T細胞療法


              過繼細胞治療經歷了漫長的探索過程,早期的過繼細胞治療一般是指:第1代LAK細胞。第2代CIK細胞,第3帶TIL細胞,第4代抗原特異性的CTL細胞。


              早期的過繼細胞療法有效率低下,而且制備過程難以標準化評估,已經被基本淘汰。目前流行的是第5代過繼細胞治療法,技術有2種,除了CAR-T細胞,還有一種叫TCR-T細胞。



              四、免疫評估



              ICIs制劑的療效主要和以下幾個因素相關:


              1. 新抗原數量:突變負荷是指正常等位基因(A)突變成有害等位基因(a)形成在選擇上不利的純合體(aa)所引起群體適應度下降的現象。如:人類的一些代謝遺傳病,象黑尿癥、半乳糖血癥等。


              用腫瘤突變負荷(TMB)來定量:被定義為每百萬堿基中被檢測出的,體細胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數。具體操作就是測量某種腫瘤體細胞內編碼蛋白的堿基突變數量,包括替換、插入/缺失等各種形式的突變;


              量化的描述TMB,可分為4類:

              1)TMB-High=>20mutations/Mb;

              2)TMB-Intermediate, 6-19 Muts/Mb;

              3) TMB-Low <= 5 Muts/Mb;


              體細胞突變可能受到外源性誘變因素的影響,比如肺癌中煙草(吸煙)誘導的C→A的突變。惡性黑色素瘤中,紫外線照射引起的C→T的突變。內源性因素引起的突變可以是DNA錯配修復突變,比如結直腸癌和食管癌中的MSI(微衛星不穩定)。在實體腫瘤中,95%的突變為單個堿基的替換,造成的非同義突變(一個核苷酸突變改變一個蛋白的氨基酸順序),錯義突變(非同義點突變,單個核苷酸改變導致一個密碼子編碼一個不同的氨基酸)和無義突變(非同義點突變使一個密碼子變為終止密碼子引起多肽鏈合成提前終止),共同構成了體細胞非同義突變的基本要素。


              2. TMB相關因素:腫瘤突變負荷(tumormutation burden,TMB)、微衛星高度不穩定(microsatellite instability-high, MSI-H)和錯配基因修復缺失(mismatch-repairdeficiency,MMR),這些潛在的bio-marker又指向一個共同點突變相關新抗原(mutation-associated neoantigen)。


              3. 腫瘤微環境種的PD-L1表達豐度及TIL數量。具體見荷蘭Christian U Blank在科學雜志撰文并畫出的影響抗癌免疫反應的7大因素雷達圖。


              4. 微生態:《科學》雜志發表的五篇腸道微生物影響腫瘤免疫治療的研究文章,來闡述免疫療法療效與腸道微生物的關系。


              2015年11月27日,《科學》雜志發表了兩篇研究,首次指出癌癥患者腸道微生物的組成,決定了以檢查點抑制劑(CTLA-4、PD-L1)為代表的癌癥免疫療法的有效性。由法國GustaveRoussy 癌癥中心的免疫學家Laurence Zivogel博士領導的研究小組發現,腸道中具有多形擬桿菌和脆弱類桿菌的小鼠,在接受CTLA-4抗體治療時,會表現出更好的治療效果;而無菌小鼠的腫瘤則對該治療幾乎沒有響應;在給無菌小鼠移植特定菌株后,可以增強CTLA-4抗體療法的有效性。來自芝加哥大學的Thomas Gajewski團隊,也通過類似的方法,證明了雙歧桿菌屬有利于PD-L1抑制劑的抗腫瘤效果。


              2017年11月2日,《科學》雜志再次同時在線發表了兩篇重磅論文。


              一篇《Gut microbiomeinfluences efficacy of PD-1–based immunotherapy against epithelial tumors》還是由兩年前的Laurence Zivogel博士團隊研究撰寫,這次的研究對象從老鼠轉移到了人類。該團隊對接受過PD-1抑制劑治療的249例癌癥患者進行了分析,其中69例患者因常規原因(如牙科治療或尿路感染),在接受PD-1治療前后服用了抗生素。那些服用抗生素的癌癥患者,因為抗生素導致腸道菌群紊亂,在接受PD-1抑制劑治療之后,癌癥很快就復發,總體生存期(OS)竟然比未服用抗生素的患者縮短了近45%!


              研究人員還將人類患者的腸道微生物移植到無菌小鼠身上,結果發現移植那些治療有效患者腸道微生物的小鼠,接受PD-1/L1抑制劑治療同樣會有效,而移植無效患者的腸道微生物,治療也就無效。具體試驗過程如下:


              ①分析249名患肺癌、腎癌等腫瘤并接受抗PD-1免疫抑制劑治療的患者,69名同時接受廣譜抗生素(ATB);

              ②ATB患者平均總生存期為8.3個月,遠遠低于非ATB患者的15.3個月;

              ③患者體內Akkermansia muciniphila(Akk菌)的相對豐度與對免疫檢查點抑制劑(ICI)的響應顯著相關;

              ④將對ICI響應的患者的糞菌移植給無菌小鼠,可以改善PD-1抑制劑對小鼠腫瘤的效果;

              ⑤移植對ICI不響應的患者糞菌的無菌小鼠,在口服Akk菌后,也能恢復對PD-1抑制劑的響應。 


              同時刊發的另一篇論文中,來自美國德克薩斯州大學安德森癌癥中心的研究人員,對112名接受PD-1抑制劑治療的癌癥患者進行了口腔和腸道微生物的分析。結果發現免疫療法有效與無效患者的腸道菌群存在顯著差異,證實腸道微生物在免疫療法中扮演了極其關鍵角色。


              2018年1月5日,ThomasGajewski團隊登頂《科學》封面,腸道微生物影響人類癌癥患者免疫治療效果再次得到證實!研究人員通過對42名轉移性黑色素瘤患者的糞菌構成進行分析,結果證明患者腸道菌群與PD-1免疫療法的效果之間存在顯著關聯,并在對治療響應明顯的患者腸道菌群中,鑒定出高豐度的長雙歧桿菌、產氣柯林斯菌和屎腸球菌,并發現在給無菌小鼠移植這些人類患者的腸道微生物后,能夠顯著增強小鼠的腫瘤免疫應答和腫瘤控制。


              有人會問,為什么不同的研究團隊鑒定出的菌群種類不完全一致,North Carolina大學Scott Bultman教授表示:“研究對象所處地理位置和飲食習慣不同,腸道菌群不同是正常的,而且不同研究之間也存在一定的重合度?!?/span>


              另外一些因素:

              療效好的:吸煙、近期放療

              療效差的:EGFR基因突變。


              KRAS突變,似乎不影響療效:總體人群的臨床獲益率為29%,攜帶KRAS突變的患者臨床獲益率是36%,兩者無統計學差異。關于這一點,要做一下額外的補充:事實上,KRAS突變的非小細胞肺癌可以分為三類。

              (1)同時攜帶KRAS和P53突變的患者,這類患者對PD-1治療敏感;

              (2)同時攜帶KRAS和STK11突變的患者,這類患者對PD-1治療抵抗;

              (3)其他患者,對PD-1治療的有效率居中。


              在本次研究中,①攜帶STK11突變的患者,接受PD-1抑制劑治療,的確是有效率更差的;②JAK突變、B2M突變的患者,要當心,③PD-L1表達和TMB高低無關④MDM2、MDM4擴增的患者,是否會發生超進展,有待進一步研究。


              五、毒性管理與療效評價


              細胞因子釋放綜合癥(Cytokine Release Syndrome, CRS):


              在CAR-T細胞治療過程中發生的一種過度免疫反應。臨床表現主要包括:發熱;特征性細胞因子升高;和臨床毒性的存在(表1)。并發CRS患者的典型發燒,通常在回輸CAR-T細胞后約24小時開始并且可以持續數天。然而,發燒并不總能夠預示臨床發生相關毒性的多少,嚴重程度和發病趨勢。


              至少7個細胞因子水平在血清中的增高與患者發生CRS具有明確的相關性,這些細胞因子是:IFN-γ (干擾素-γ),Fracktalkine (分形趨化因子),GM-CSF (粒-巨噬細胞生長因子),IL-5(白細胞介素-5),IL-6(白細胞介素-6),Flt-3L (人FMS樣酪氨酸激酶3配體)和IL-10 (白細胞介素-10)。


              7種細胞因子在需要治療的重癥CRS患者中,至少有2項比治療前基線水平增高75倍。重癥CRS患者都出現了至少一個下述臨床表現:缺氧,低血壓,和/或神經系統的異常改變。


              因此,結合臨床和實驗室數據,可以根據以下3項指標來確診患者CRS的發生:

              1. 持續發燒超過3天(~38C°);

              2. 選擇性細胞因子升高;

              3.伴有臨床毒性反應的證據。


              上述標準可以將患者分為重癥CRS組和非CRS組。非CRS組患者包括未發生CRS患者,也包括僅有低熱和輕度細胞因子增高的輕度CRS患者。重癥CRS患者需要密切觀察和治療干預。非CRS患者僅需要常規觀察和一般性對癥處理。重癥CRS患者平均住院時間為56.7天(SD=28.6;范圍20-104天)。非CRS患者平均住院15.1天(SD=18.8;范圍:4-61天)。


              盡管在CAR-T治療引起的嚴重副作用發生之前,檢測血清CRS相關細胞因子,可以指導臨床診斷和治療,但是每天快速實時檢測細胞因子,因技術上的限制并不現實可行。研究發現,血清急性反應蛋白之一,C-反應蛋白(CRP)水平的增減與CRS時患者血清IL-6水平和IL-6受體阻滯劑治療后顯著相關。同樣C-反應蛋白水平與類固醇藥物對CRS的療效顯示了明顯的負相關。因此認為C-反應蛋白是預測CRS的一個良好指標。C-反應蛋白水平超過正常閾值預示具有CRS發生的高度危險性,C-反應蛋白測定的敏感性約86%,而特異性為100%。 



              細胞因子釋放綜合癥的處理


              重癥CRS產生的不良反應和毒性作用需要有效和強力的醫療干預。通常包括血管活性升壓藥支持,呼吸機支持,使用抗癲癇藥和解熱鎮痛藥物。盡管這些毒副作用令人擔心,迄今為止,在正確有效的醫療處理條件下,臨床上CRS已經是完全可逆性的。


              采用大劑量類固醇激素相當于每天100mg以上強的松劑量,可以迅速逆轉CRS的臨床癥狀。然而,問題的另一方面是,類固醇藥物也能抑制CAR-T的體內增殖,使得使用類固醇類藥物治療CRS的患者,有較高的復發率,影響CAR-T治療的療效。


              白細胞介素-6受體(IL-6R)阻斷性單克隆抗體藥物(Tocilizumab)也可以用來治療和改善CRS的毒副作用。已有臨床試驗證明,阻斷IL-6受體后能迅速解決CRS帶來的毒副作用。在3例CRS患者中(患者血清中IL-6濃度增高達正常濃度的27-400倍),單獨使用Tocilizumab抗體后,患者發燒和CRS癥狀在1-3日內明顯緩解,療效與類固醇療法相似,外周血檢測顯示Tocilizumab治療對CAR-T細胞體內增殖沒有影響。


              CAR-T治療能引起對神經系統的毒性作用?;颊呖赡艹霈F可逆性神經系統并發癥。包括神志不清和癲癇樣癥狀?;颊呖梢园l生漸進性的神志混亂,詞語困難,失語,可最終發展到反應遲鈍。有些患者的神經系統并發癥發展到需要氣管插管及機械輔助通氣等措施,以便對呼吸道加以保護。對神經系統并發癥的檢查,CT和磁共振成像常無特別發現。腦電圖能確診癲癇樣腦電波活動,有助于指導抗癲癇治療的處理。


              ICIs治療相關毒性管理:


              針對細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxicT lymphocyte-associated antigen 4, CTLA4)和程序性死亡受體(programmed death-1 receptor,PD-1)及其配體PD-L1的單克隆抗體(monoclonalantibodies,MoAbs)治療已經成為越來越多腫瘤的標準治療。越來越多的患者應用這些藥物的同時也可能會出現治療相關的毒性。毒性發生率在不同的免疫檢查點抑制藥物之間也不盡相同。


              免疫檢查點抑制劑(immunecheckpoint inhibitors,ICPi)的毒性可以分為輸注反應和免疫相關不良事件(immune-related adverse events,irAE)或特殊關注的不良事件(adverseevents of special interest,AEoSI)。ESMO臨床實踐指南僅涉及后者。雖然某些臟器的irAE更加常見,但實際任何器官和組織都有可能受累。最常發生的irAE主要累及皮膚、結腸、內分泌器官、肝臟和肺;其他組織和器官雖然少見,但有可能相對更嚴重、甚至是致命的,比如神經系統病變和心肌炎。


              Ipilimumab的免疫相關毒性

              Ipilimumab,一種抗CTLA4單抗,臨床劑量為3mg/kg時,60%~85%的人群出現irAE:大多數是1~2級毒性,約10%~27%的人會發生3~4級毒性,在早期的3期臨床研究中有2.1%的患者出現ipilimumab相關的死亡。這些毒性發生的時間各不相同,但大多出現在治療開始后的8~12周[圖中列出了ipilimumab治療后不良事件(adverseevents,AE)的發生時間],皮膚毒性常為首發癥狀。這些毒性特征表現為劑量依賴性:ipilimumab劑量為0.3 mg/kg時并沒有觀察到3~4級的不良事件,而使用10mg/kg時,3~4級毒性上升到30%。當ipilimumab 10 mg/kg繼以維持劑量作為輔助治療時,3~4級irAE的發生率為41.6%,5級irAE的發生率為1.1%。對于1-2級的皮膚AE,繼續應用(至少1周)ICPi。如果出現瘙癢,則開始應用外用潤膚劑、抗組胺藥和/或糖皮質激素(低強度)乳膏。當AE≤1級時重新開始應用ICPi。對于3級的皮膚AE,暫停ICPi,并立即應用外用潤膚劑、抗組胺藥和高強度的糖皮質激素乳膏[II, B]。對于4級的皮膚AE,停用ICPi(永久),考慮收患者入院,并立即與皮膚科醫生會診。開始應用經靜脈給藥的糖皮質激素[1–2 mg/kg(甲基)強的松],并根據AE的緩解情況逐漸減量[II, B]。


              療效評價

              目前的試驗結果發現腫瘤微環境中PD-L1和淋巴細胞雙陽性的病人在黑色素瘤中有45%,肺癌中有17%, 膀胱癌中有32%,這個比例和臨床試驗抗PD-1/PD-L1治療的反應率很相似。


              2009年國際上建議并制定腫瘤免疫治療的療效判斷新標準—免疫相關反應標準(Immune-RelatedResponse Criteria,irRC),以彌補RECIST或改良后的WHO標準并不完全適用于抗腫瘤細胞免疫治療的缺陷。



              六、ICIs耐藥現象的解釋


              為何有些腫瘤抵抗PD-1/PD-L1治療,陳列平教授將耐藥性腫瘤分為3類: 

              ① Target-missingresistance:這些腫瘤不表達PD-L1,或者有PD-L1但沒有T淋巴細胞(缺乏PD-1),因此屬于靶子缺失型。這種腫瘤對PD-1/PD-L1抗體治療不可能有效果。明顯有其他逃逸機制在起作用。 

              ② Primaryresistance:腫瘤微環境中有PD-L1,也有T細胞,但病人對PD-1/PD-L1抗體治療沒有反應。 這樣的情況比較少見。

              ③ Acquiredresistance:腫瘤微環境中有PD-L1,也有T細胞。病人對PD-1/PD-L1抗體治療最初也有反應,但是后來腫瘤復發,用PD-1/PD-L1抗體再治療也無效。這一種才是真正的耐藥。


              MD安德森的Padmanee Sharma發表文章《Primary, Adaptive, andAcquired Resistance to Cancer Immunotherapy》討論ICIs的耐藥機制。


              腫瘤免疫療法的一個顯著特點是腫瘤響應的時間長,但是在使用anti-CTLA-4或anti-PD-1治療黑色素瘤的患者中,大約有1/4-1/3的患者在經歷初始響應后出現了腫瘤進展,即獲得性耐藥。獲得性耐藥的產生的主要是腫瘤細胞上特定基因或通路的表達或上調,從而導致腫瘤微環境中免疫細胞的浸潤以及功能受到抑制。例如,T細胞功能的喪失,腫瘤抗原提呈出現缺陷以及其他一些新突變的產生。例如,在一類較晚獲得anti-PD-1耐藥性的病人中,發現了B2M的突變,從而導致抗原提呈機制缺陷。在另兩例獲得性耐藥腫瘤中,發現了IFNγ通路中JAK1或JAK2發生了突變。PD-1抗體只是解除了“T細胞枷鎖”,疾病的控制最終還是要通過T細胞實現,因此,凡是影響T細胞招募、激活等功能的,均能夠最終影響PD-1抗體的臨床收益。


              導致免疫療法耐藥的腫瘤內在原因:


              ①MAPK通路的激活與或PTEN表達的缺失而引起的PI3K通路的增強:

              癌基因信號通過MAPK通路導致VEGF與IL-8的產生,從而抑制T細胞的招募與功能。腫瘤抑制基因PTEN表達缺失從而PI3K通路增強,這與IFNγ,顆粒酶B的基因表達量降低以及腫瘤浸潤CD8+T細胞的數目減少是高度相關的。


              ②WNT/β-catenin信號通路的持續表達:

              癌基因信號通過穩定β-catenin導致WNT信號通路持續激活,從而將T細胞排除在腫瘤之外。在人Non-T-cell-inflamed的黑色素瘤中,腫瘤內在的β-catenin信號基因高度表達,且在腫瘤微環境中缺少T細胞與CD103+DC細胞。


              ③腫瘤上PD-L1的高表達:

              腫瘤上高表達的某些配體如PD-L1,會抑制抗腫瘤T細胞的應答。多種機制可能導致PD-L1高表達,包括PTEN的缺失或PI3K/AKT的突變,EGFR突變,MYC過表達,CDK5基因破壞以及PD-L1基因3’-UTR的截短。目前還不知道PD-L1的高表達是否會對anti-PD-1/PD-L1的響應有影響,但是它會影響其他的腫瘤免疫療法。

              IFNγ信號通路的缺失:由腫瘤特異的T細胞產生的IFNγ,能夠識別腫瘤細胞或抗原遞呈細胞上的相應受體,從而發揮有效的抗腫瘤免疫響應。IFNγ能夠增強MHC分子的表達,從而增強腫瘤抗原提呈作用。IFNγ也能夠招募其他的免疫細胞,或者直接抑制腫瘤細胞的增殖,促進其凋亡。因此腫瘤細胞上IFNγ通路相關蛋白,如IFNγ受體IFNGR1與IFNGR2,IFNγ受體鏈JAK1與JAK2,STATs,IRF1等突變與缺失,都會導致對免疫檢查點抑制劑的耐藥。


              ④缺少腫瘤抗原:

              免疫療法依賴于腫瘤抗原特異的T細胞。在人黑色素瘤,腎細胞癌,非小細胞肺癌中,DNA突變頻率高,腫瘤免疫原性更強,因而對anti-PD-1療法響應更好。而在胰腺癌以及前列腺癌中,DNA突變頻率低,腫瘤免疫原性低,對anti-PD-1療法響應差。


              ⑤抗原提呈機制存在缺陷:

              在某些情況下,由于抗原加工過程中的蛋白酶體成員,轉運蛋白,MHC本身以及beta-2-微球蛋白(B2M)的功能缺陷,會導致抗原提呈機制不能有效地將腫瘤抗原提呈到細胞表面。B2M在HLAI家族的折疊與轉運到細胞膜的過程中發揮關鍵作用,若其喪失功能,則CD8+T細胞失去了識別功能。


              ⑥存在一系列特定基因的表達:

              在對PD-1療法沒有響應的腫瘤中,有一些基因表達被富集,被稱為innate anti-PD-1 resistance signature,或IPRES。這些基因與間葉細胞的轉化,全能型以及傷口愈合相關,且更傾向于表達在胰腺癌等對PD-1不響應的腫瘤中。



              導致原發性/繼發性耐藥的腫瘤外部原因:


              這些原因是由于腫瘤微環境中一些成員發揮抗癌免疫響應的抑制作用,主要包括調節T細胞Tregs,髓樣抑制細胞MDSCs,M2巨噬細胞,其他的抑制性免疫檢查點與抑制性細胞因子等。


              ① Tregs:

              Tregs能通過分泌抑制性細胞因子或者通過直接的細胞接觸來抑制效應T細胞Teffs的響應。許多人腫瘤中發現了浸潤的Tregs,且鼠模型中去除腫瘤微環境中的Tregs能夠顯著提高免疫響應。由于CTLA-4在Tregs上高表達,anti-CTLA-4能夠顯著提高Teffs/Tregs的比例,從而提高腫瘤對免疫療法的響應。


              ② Myeloid-derivedsuppressor cells (MDSCs):

              MDSCs在多種病理條件包括腫瘤,發揮著免疫響應調節因子的作用。人MDSCs表達CD11b+與CD33+,但是不表達HLA-DR以及系種特異的抗原CD3,CD19與CD57。MDSCs能夠促進血管生長,腫瘤侵襲與轉移。腫瘤微環境中MDSCs的存在與降低的生存率以及免疫檢查點抑制劑療法的響應率相關。目前實驗中使用PI3Kγ抑制劑來調節巨噬細胞功能,在老鼠模型中,PI3Kγ抑制劑與anti-PD-1聯用表現出了良好的腫瘤抑制效果。


              ③ M2macrophages:

              腫瘤相關的巨噬細胞(Tumor-Associated Macrophages,TAMs)也能夠影響免疫治療的響應。TAMs包括M1巨噬細胞和M2巨噬細胞,在大多數情況下M2巨噬細胞占TAMs的大多數。其中M1巨噬細胞能夠高表達IL-12,IL-23,MHC以及B7家族分子來促進抗原提呈與Th1細胞的激活,從而發揮抗腫瘤免疫作用;而M2巨噬細胞能夠分泌抑制性細胞因子IL-10與TGF-β,從而抑制免疫響應與促進腫瘤生長與轉移。臨床上TAMs的數目越多,腫瘤預后就越差。臨床前實驗使用巨噬細胞集落刺激生長因子受體1(CSF-1R)的抑制劑,能夠顯著減少TAMs數目,抑制腫瘤生長。CSF-1R抑制劑與anti-CTLA4或anti-PD1再加上吉西他濱聯用,能夠有效緩解單獨anti-CTLA-4或anti-PD1不響應的鼠胰腺癌模型。


              ④ 其他的抑制性免疫檢查點:

              除了PD-1與CLTA-4,T細胞上還存在其他的抑制性免疫檢查點,包括TIM-3,LAG-3,BTLA,TIGIT,和VISTA等。2016年《naturecommunication》上,有研究者發現anti-PD-1耐藥性的產生與抑制性免疫檢查點TIM-3的的表達量升高密切相關。在兩個老鼠腫瘤模型中,耐藥后與給藥前相比,腫瘤浸潤的T細胞而非外周血或脾臟T細胞上的TIM-3表達量顯著上調,且TIM-3表達量上調的主要是那些結合了anti-PD-1抗體的T細胞。需注意的是TIM-3表達量升高是anti-PD-1療法特異的,因為anti-CTLA-4中并未檢測到類似現象。此外,腫瘤細胞上TIM-3配體Galectin-9的表達量也顯著升高。當anti-PD-1療法出現耐藥后,聯用anti-TIM-3,顯著提高了生存率。有意思的是,當anti-PD-1和anti-TIM-3聯用被耐藥,腫瘤重新進展時,那些結合了anti-PD-1和anti-TIM-3抗體的T細胞上,其他的抑制性免疫檢查點如CTLA-4,LAG-3的表達量明顯升高。這說明了腫瘤浸潤T細胞的抑制性免疫調節是動態變化的,存在著補償效應。最后,在兩例對anti-PD-1療法獲得性耐藥的NSCLC病人腫瘤樣本中,也觀察到了TIM-3而非其他抑制性免疫檢查點的表達量顯著升高。這些結果說明了anti-PD-1和anti-TIM-3聯用是對于那些anti-PD-1療法獲得性耐藥病人的一個良好策略。


              免疫抑制細胞因子與免疫抑制分子:


              腫瘤或者巨噬細胞會釋放一些免疫抑制細胞因子或者免疫抑制分子來減弱局部的抗腫瘤免疫反應。腫瘤微環境中的免疫因子或免疫細胞的異常表達


              某些免疫因子如激活型免疫因子(IL-12,IL-23),抑制性免疫因子(IL-10與TGF-β),免疫細胞如Tregs, Myeloid-derivedsuppressor cells 等能夠顯著影響抗體的臨床治療效果。TGF-β能夠促進血管生成,刺激Tregs從而發揮免疫抑制作用。在多種腫瘤中,高水平的TGF-β都伴隨著極差的預后。臨床前實驗使用TGF-β受體激酶抑制劑與anti-CTLA-4聯用,或者放療與TGF-β抑制劑都顯示出了較好的腫瘤抑制效果。在細胞外,CD39能夠將ATP水解成AMP,進一步被胞外核苷酶CD73加工為免疫抑制分子腺苷adenosine。Adenosine能夠通過T細胞上的A2A受體抑制T細胞的增殖與細胞毒活性,也能通過腫瘤細胞上的A2B受體促進腫瘤轉移。多種類型的腫瘤中,CD73的高表達伴隨著較差的預后,且會影響anti-PD-1的效果。此外,IFNγ會促進免疫抑制分子IDO的表達,IDO能直接負調控效應T細胞的功能。


              趨化因子與趨化因子受體:


              某些特異的趨化因子與趨化因子受體在MDSCs和Tregs往腫瘤微環境的運輸過程中起到重要作用。腫瘤細胞能夠分泌配體CCL5,CCL7和CXCL8,通過結合MDSCs上表達的CCR1及CXCR2受體,從而將MDSCs吸引至腫瘤微環境中。CCR4在Tregs上高表達,anti-CCR4能夠有效抑制T細胞的招募并通過ADCC效應減少Tregs的數目。此外CXCR4是CXCL12的受體,CXCL12能夠通過影響Tregs定位等多種方式發揮免疫抑制作用。


              腫瘤浸潤細胞上CD28的表達:


              CD28是T細胞的共刺激分子,對于T細胞的激活,增殖和存活起到關鍵作用。在人出生時,所有T細胞都會表達CD28,但是CD28的表達量會隨著年齡的增加而下降,80歲時會有10-15%的CD4+T細胞以及50-60%的CD8+ T細胞缺失CD28表達。CD28-T細胞產生的主要原因是重復的抗原刺激。CD28表達的消失只存在與人和靈長動物中,在鼠中并沒有被發現。


              2017年03月09號,science期刊發表了來自Emory疫苗中心的研究工作,他們發現CD28對于耗盡的CD8+T細胞(ExhaustedCD8+ T Cell)的再激活是必須的。在老鼠模型中,阻斷CD28-B7共刺激通路,會影響腫瘤特異CD8+T細胞的增殖和激活,降低對anti-PD-1/PD-L1療法的響應。在經過anti-PD-1治療的NSCLC病人中,增殖的CD8+T細胞(高Ki-67表達)大都為PD-1陽性,且被激活(高HLA-DR,CD38表達)。和鼠模型中一樣,這些增殖的CD8+T細胞大都是CD28陽性的,說明了CD28共刺激對于腫瘤浸潤的PD-1+CD8+T細胞的增殖與再激活是至關重要的。因此,CD28可以用作預測anti-PD-1療法響應程度的分子標記。


              抗體藥物失效的可能原因是巨噬細胞“吃掉”了它:


              MGH研究人員將PD-1抗體opdivo、腫瘤細胞、T細胞、巨噬細胞等分別染色,發現PD-1抗體能夠與巨噬細胞表面的Fcγ受體結合,從而被巨噬細胞“吃掉”,這在體外細胞實驗和小鼠體內均得到證實,同時研究人員發現酶PNGaseF能過抑制該吞噬過程,這給PD-1抗體臨床治療方案的優化提供思路。



              ICIs抗體藥物耐藥對策:

              ①聯合用藥:多個免疫檢查點抑制劑藥物的聯合使用(opdivo聯合yerovy)。

              ②抗體藥物和化療藥物的聯合使用:如keytruda+培美曲塞+卡鉑聯合治療方案。

              ③在生物標志物的指導下采取個性化治療方案,以獲得更高的臨床收益。


              七、臨床應用



              人類對癌癥的認知經歷了細胞與分子生物學水平的演進,目前對癌的解釋可以概括為:自身體細胞在基因組突變積累的基礎上出現失控增殖表型和遷移失控表型并可能表達異常信號分子,通過占位效應和分子毒性效應導致原宿主多細胞系統代謝奔潰的生命現象。


              這種現象見于各種動物,但不同物種發病率不同,在人類60歲以后癌癥是常見致死致殘性疾病,如果一個人活到80歲有50%可能性出現癌癥類現象,癌癥的異質性很大,有些即使很大也未必致死,有些即使轉移也能較長時間存活。


              人類在癌癥免疫療法取得突破性進展之前主要的局部治療有:外科式手術刀或者物理化學消融性微創外科、放射線治療、化學藥物、分子靶向藥物(各種抗體或者小分子酪氨酸激酶抑制劑)。


              當前比較成功的抗癌免疫治療方法是CART-T過繼免疫治療和免疫檢測點抑制劑。前者在血液腫瘤取得了很大的成功,后者在血液腫瘤及實體腫瘤均顯示了療效。傳統的抗癌療法與免疫治療具有協同效應,而且傳統的抗癌療法也對免疫系統或免疫反應有一定影響:


              ① 化療藥物吉西他濱、卡培他濱及環磷酰胺在破壞癌細胞的同時釋放的癌細胞壞死物比其它化療或分子靶向內分泌藥物更具有抗原性。


              ② 物理如放射線或者物理化學消融如熱冷及酒精等消融技術殺死的癌細胞裂解物也具有一定免疫原性,甚至可導致殘余腫瘤消退。


              ③ 外科大手術創傷大具有免疫抑制效應,切除過程中的癌細胞破碎可導致癌細胞脫落轉移,當然也可能會導致免疫原性反應。


              未來的方向是:

              ①了解原發和繼發耐藥的機制。

              原發耐藥:微環境中缺乏靶點,或者存在另外的免疫抑制機制。

              繼發耐藥:TME發展出一些針對ICIs的新機制,如直接吞噬抗體。


              ②了解TME免疫抑制的整體框架。




              現在看來,在癌癥病灶中肯定存在著一種類似保護罩似的局部結構,我覺得可以從以下幾方面理解:



              ③闡明轉移癌細胞離開腫瘤微環境為啥可以存活的機制。理解轉移前和轉移后微環境的免疫學性質變化。


              癌細胞離開創始根據地去宿主的其它地盤上開疆拓土是一件風險極大的事情。進入血液中的癌細胞存活下來的機率非常低,多數被殺死或者自己死亡。能夠粘附血管壁并進入周圍組織存活下來的又低了許多。不過有證據表明,即使血液中可以檢測到存活癌細胞,但最終的解決有以下幾種:


              ④闡明構建癌癥免疫和代謝之間的關系。

              代謝是生命的基本特征,所有有生命系統的根本特征。本質上所有的生命都是由基本粒子組成的,基本粒子組成了原子,原子組成了分子,這種不斷的系統化后使得系統有了超級復雜性和有序性。為了維持超級系統,系統必須要代謝物質并攝入能量。


              免疫是廣義的代謝概念的一種,代謝包含了免疫機能在內。多細胞化后的動物代謝負荷加大,為了供應所有的細胞盡可能獲得營養物質,多細胞體系特化了循環系統;為了提高攝食效率,發展了運動系統;為了協調運動系統和內在運動系統循環系統的效率,發展了神經系統。神經系統是一種高級精準的協調系統,后來居上地位于內分泌和免疫系統之上,免疫系統是消化系統的補充系統。內分泌系統負責各功能細胞群的遠距離近距離通訊,媒介為化學分子。


              ⑤闡明癌癥免疫與細胞行為調控的關系。

              人體細胞在過去的35億年里一直在變化,直至成為今天的細胞形態與功能之前它經歷了復雜的演化過程。最近6億年的演化過程中,人體細胞的祖先是一個開放的系統,接受一切有利于自己的整合。人類基因組中的基因規模目前尚不是很清楚,推測由3萬條基因單位。這些基因是長時間和地球外界自然環境相互作用的結果,經歷了殘酷的自然選擇過程和對外界的同化過程,才建立起了今天的規模。人類基因組呈現豐富的多態性,既與演化的分支有關,如6萬年前就與歐洲人分開的亞洲人與歐洲人之間存在顯著的表型差異;也與外界環境有關,如病毒基因組序列對人類基因組的轉染與整合,外界自然有利有害突變的積累,以及生活方式和生殖方式對現有基因組體系構建的影響。


              免疫系統的基本架構早在單細胞階段就已構建了起來。例如免疫球蛋白的結構在人體內是一個巨大的家族,包括了細胞上的受體(TCR)、MHC等,根據FC段的不同又分類為5種免疫球蛋白。到了多細胞階段后,免疫系統已經分化為一個龐雜巨大的網絡系統,雖然經常出錯:如不能完全遏制由于人類基因組不穩定性帶來的異常增殖性突變,本來細胞的增殖是統一于宏觀的神經內分泌調控的。這種增殖可能會伴有移動性病灶擴散,即所謂的惡性增殖、毒性增殖。


              題外話:物理學視角下人生演化過程



              基本粒子的費米特性,泡利不相容原理,使得原子組成的世界按照層次的原則組建了起來,出現了多層次的生物進化。每個生物個體都是一個宇宙在重演的宇宙的歷史,個體人也不例外。多細胞動物人雖然看起來很復雜,其實基本的構成不外代謝與免疫2個,還有一個是與其共生的微生態。


              代謝是外在的免疫,免疫是內在的代謝;代謝的本質是同化,免疫的本質是清除。


               

              癌癥是典型的多細胞增殖失控性疾病。一般認為,地球生命在6億年前出現多細胞生命,現存的海綿類多孔動物門是最早出現的多細胞動物。人類的疾病多少與先天發育不足有關,另外一些與后天的損傷有關。人體內的主要系統只有2種:代謝和免疫,所有的疾病不外此2種。


              1億年前,鼠與人類的共同祖先出現。


              人與人之間的基因組相似度在99.99%。我們血緣關系最近的親屬——黑猩猩,在基因上與我們人類的相似度達到了96%。人類和獼猴共有93%的DNA。貓的基因與我們人類有著90%的相似性。


              當涉及到蛋白編碼基因時,老鼠與我們有著85%的相似度,但是在非編碼基因上,只有大約50%的相似度。國家人類基因研究所把這種相似性歸咎于大約8千萬年前的共同祖先。幾乎所有的人類基因在老鼠身上都有個明確的對應基因,但是蛋白質編碼基因只占據了各自基因組的1.5%,基于此,能治愈老鼠的化合藥物通常對人類無效。


              2009年《科學》雜志上的一篇報道,家牛與我們人類共享大約80%的基因。雞與人類共享了大約60%的基因。果蠅與人類共享了61%的致病基因,這對于美國宇航局探索太空旅行可能對人類基因產生的影響非常重要。香蕉也與人類共享了大約60%的基因。


              目錄


              一、免疫發展史

              二、免疫學原理

              三、主要抗癌免疫療法

              四、免疫狀態評估

              五、免疫治療毒性和療效評估

              六、ICIs耐藥現象的解釋

              七、臨床應用


              一、免疫治療簡史


              免疫系統是多細胞動物特化的一個系統,用以維持多細胞動物在細胞層面和分子層面的穩定性。在單細胞動物中存在的原始基本機制是多細胞化后復雜機制的基礎,類如在單細胞動物中的分子系統CRISPR-cas系統就是一個維護單細胞穩定性的免疫機制。


              1909年Paul Ehrlich提出免疫監視學說,認為免疫系統可以遏制腫瘤的發生,免疫功能異常是腫瘤發生的基本原因之一。


              1959年Frank Macfarlane Burnet和Lewis Thomas(曾任MSK院長)提出了“免疫監視(tumor immune surveillance)”的假說,該假說認為免疫系統能夠識別并清除惡性腫瘤,從而抑制了腫瘤的發生發展。


              2002年Gavin P Dunn和RobertD Schreiber等首次提出了腫瘤免疫編輯(Tumor Immunoediting)學說,系統闡述了癌癥和免疫系統之間的三階段關系。


              二、抗癌免疫學的基本原理


              100余年人類對免疫系統的不懈研究,目前已經對該領域的主要問題有了一些粗淺的認識。陳列平教授將人類對抗癌免疫的認識過程總結為,三大基本問題:有沒有?免疫原性的狀態如何?啟動抗癌免疫的相關因素。即:


              (一)人類機體內是否存在清除癌細胞的免疫反應?


              答案是肯定的!


              1868年一位叫威廉.布什(WilhelmBusch)的醫生第一次報道,有意使用丹毒感染癌癥病人后腫瘤顯著縮小。1891年,美國紐約紀念醫院骨科醫師威廉.科利(WilliamB.Coley,1862~1936)開始以注射細菌進入腫瘤的方法治療癌癥,創立“科利毒素”療法。這種方法療效并不穩定,而且可能死于感染;改進后混合加熱過的細菌液變得安全,經這種方法確實有不少人惡性腫瘤在無藥可醫的情況下得到了緩解,甚至是長期緩解。曾經一睹被打壓的早期免疫治療探索今天已經得到世人的認可,并以其名字命名了免疫界最高獎項為威廉.科利獎。


              如細胞因子療法、過繼免疫細胞療法及免疫檢查點抑制劑療法的效果已經被證實,其中有廣泛意義的是ICIs,在多數癌種均有一定比例的患者獲得療效,和既往的化療及分子靶向治療的機理完全不同。


              (二)是否存在特異性的抗原以引發清除癌細胞的特異性免疫反應?


              癌細胞來源與人體自身細胞,存在抗原,但是經歷了免疫編輯后的癌細胞抗原性較弱,難以有效激發免疫反應。而且在腫瘤微環境局部存在復雜的免疫抑制或免疫逃逸,導致免疫反應不能有效完成。


              抗原是激發免疫反應的起點,未來這個問題尚需要繼續充分研究。比利時的Thierry Boon教授長期研究癌細胞抗原問題。對于一個已經進入臨床階段并進展的癌癥病灶(原位持續增殖或者可轉移的),有沒有癌細胞獨有的抗原?進展狀態的病灶存不存在人體細胞在任何時期都沒有表達過的抗原性質(免疫原性)的物質?


              目前看癌癥抗原領域有如下觀點:

              癌細胞存在獨有的抗原嗎?還是共享的?例如有些CEA/AFP是人類胎兒時期的蛋白質,且功能現在也不清楚。癌變后,這些本來應該沉沒的基因重新激活并大量表達。不知道癌細胞是紊亂表達還是功能性表達。存在癌細胞專有表達的基因嗎?目前看是有的,很少,要么表達少,要么已經被免疫掉,要么免疫原性不足。


              比利時學者Thierry Boon長期研究抗癌免疫反應的核心問題癌癥抗原,他說癌細胞的抗原性才是主要問題??乖圆蛔闶钱斍癟ME免疫抑制/逃逸的解除只能解決部分問題的一個重要原因。


              BOX:癌癥抗原問題:沒有抗原性就沒有免疫反應


              抗原本身的因素 

              異物性

              抗原與機體的種系關系越遠,其差異越大,免疫原性也就越強。

              1)異種間的物質:病原微生物、動物免疫血清對人是良好抗原。

              2)同種異體間的物質:人紅細胞表面ABO血型抗原系統及同種異體皮膚和器官上的組織相容性抗原。

              3)自身抗原:自身物質一般無抗原性。

              a:與淋巴細胞從未接觸過的自身物質(如晶狀體蛋白)

              b:自身物質理化性狀發生改變(外傷、感染、藥物、電離輻射等)


              理化性狀

              1)分子大小 

              一般說來分子量越大,抗原性越強。具有抗原性的物質,分子量一般在10.0kD以上,個別超過100.0kD,低于4.0kD者一般不具有抗原性。

              2)化學結構的復雜性,

              蛋白質,芳香族氨基酸為主者,尤其是含酪氨酸的蛋白質,抗原性強,非芳香族氨基酸為主者,抗原性較弱。

              3)分子構象和易接近性

              4)物理狀態,

              一般聚合狀態的蛋白質較其單體免疫原性強,顆粒性抗原強于可溶性抗原。


              免疫途徑和抗原劑量

              具備上述條件的抗原物質可因進入機體的途徑和劑量的不同而免疫效果迥異。

              人工免疫時,多數抗原是非經口進入(皮內、皮下、肌肉、靜脈、腹腔注射)機體才具有抗原性。


              機體方面的有關因素 

              1)宿主與抗原來源的種系進化關系

              2)宿主的遺傳背景

              3)機體的健康和營養狀況

              以上幾方面因素在一定程度上是相互制約的。


              (三)如何激發抗癌免疫反應?


              激發免疫反應涉及到很多復雜的方面,如果有時間精力也可以做一個像Daniel Chen的框架圖,就現狀而言,我們仍處在暗室之中,只是偶爾發現了幾個分子開關,更加復雜的網絡還沒有被發現。

              荷蘭Christian U Blank在科學雜志撰文描述了影響抗癌免疫反應的7大因素,并用雷達圖描繪出來。大概可分類為幾類:


              ① 癌細胞本身的:如有氧酵解水平的LDH,細胞膜表面的抗原負荷、MHC表達,負反饋作用的PD-L1表達。

              ② 血液中的:CRP、IL-6所反應的慢性炎癥水平;這些標志物反映了人體內有不能清除的抗原異物。一如生理性自身免疫反應在于清除體內衰老的廢物代謝物一樣,使用的是IgM快速清除機制,而如果是病理性自身免疫反應就需要動用慢性炎癥反應機制,IgG系統。還有一個是循環血液中的免疫細胞數,這個反應了宿主的免疫系統狀態。

              ③微環境中的:TME中的TIL反應了免疫細胞是否能夠進入最后階段,這一階段停止于局部的免疫抑制或免疫逃逸。


              值得注意的是Blank沒有討論微生態在抗癌免疫中的價值,或許是缺乏可檢測標準吧。微生態是一個重要的方向,科學雜志的癌癥免疫治療專輯曾專門發文討論。


              三、主要抗癌免疫療法


              抗癌免疫療法的歷史悠久,最早是1868年一位叫威廉.布什(Wilhelm Busch)的醫生第一次報道,有意使用丹毒感染癌癥病人后腫瘤顯著縮小。丹毒(erysipelas)是一種累及真皮淺層淋巴管的感染,主要致病菌為A組β溶血性鏈球菌。誘發因素為手術傷口或鼻孔、外耳道、耳垂下方、肛門、陰莖和趾間的裂隙。


              1891年,美國紐約紀念醫院骨科醫師威廉.科利(William B.Coley,1862~1936)開始以注射細菌進入腫瘤的方法治療癌癥,創立“科利毒素”療法。這種方法療效并不穩定,而且可能死于感染;改進后混合加熱過的細菌液變得安全,經這種方法確實有不少人惡性腫瘤在無藥可醫的情況下得到了緩解,甚至是長期緩解。由于20世紀初更加安全有效的放射療法已經開始普及,科利毒素療法開始被MSK醫院禁止,直至后來被ASCO禁止,雖然ASCO最終撤銷了禁令。后來科利的女兒繼承了父親的遺志,曾出巨資資助癌癥免疫治療研究。曾經一睹被打壓的早期免疫治療探索今天已經得到世人的認可,并以其名字命名了免疫界最高獎項為威廉.科利獎。


              根據已知的免疫學原理,推測這種利用細菌感染治療癌癥的機制是以細菌抗原調高機體對腫瘤的反應性,是先天免疫和后天免疫均處于激活狀態。細菌和自身衰老損傷細胞即癌變細胞均為同一種免疫機制清除,之間并無嚴格的界限,甚至有相當部分功能處于重疊狀態。


              然而由于人類對自身小宇宙中的這個神秘系統認知的局限性,很長時間以來人類并沒有找到可靠的免疫治療方法。直到兩種免疫治療手段出現:


              1. 針對癌細胞的抗體治療

              癌細胞上有一些特殊的抗原,人類使用免疫學抗體原理清除他們以達到治療癌癥的目的,這些治療取得了一定療效。


              赫賽汀單抗:針對癌細胞的生長刺激因子,即人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)。該基因,即c-erbB-2基因,定位于染色體17q12-21.32上,編碼相對分子質量為185000的跨膜受體樣蛋白,具有酪氨酸激酶活性。這個受體被阻滯后,癌細胞的生長轉移特性受到抑制。但是由于癌細胞不止一種生長刺激因子,所以即使癌細胞初始表達這種受體,但是初始僅有50%左右的病人對這種治療有效,幾乎所有病人會在一年內對該抗體治療耐藥。


              2. 細胞間質如血管是癌癥病灶必須的,針對癌癥病灶中的細胞間質治療。

              AVASTIN(貝伐單抗):針對VEGF這種細胞因子的抗體,可以引發抗體反應清除這種細胞因子,阻斷體內新生血管的形成來阻滯癌癥的進展,代價是人體正常的血管新生的生理過程也受到干擾。


              3. 免疫檢測點抑制劑(ICIs)


              免疫檢測點是指位于效應T細胞上的一些激活性和抑制性受體調節開關,使用激活性抗體可以啟動該受體下游的功能(激活或者抑制),激活可以使得T細胞處于攻擊狀態,抑制可以使得T細胞處于安靜狀態。人體內有100萬億個種類各異的真核細胞,如何精準地調節T細胞的免疫攻擊性能是一個受到多種機制調節的過程,其中免疫檢測點是其中的一種調節機制。


              第一個被應用于醫療實踐的免疫檢測點是CTLA-4,由美國學者James Allison發現并花了10年左右證實其功能。第二個被發現的該類分子是PD1/PD-L1,PD1首先被日本學者本庶佑發現,并被證實其效用;而PD-L1是被美籍華人學者陳列平發現的,后也被證實其效用。


              當前的主要ICIs就是基于這幾個靶點設計的。免疫檢測點由很多,其它分子也有潛在的開發價值,相關藥物正在研發中。


              4. 過繼細胞療法CAR-T細胞療法


              過繼細胞治療經歷了漫長的探索過程,早期的過繼細胞治療一般是指:第1代LAK細胞。第2代CIK細胞,第3帶TIL細胞,第4代抗原特異性的CTL細胞。


              早期的過繼細胞療法有效率低下,而且制備過程難以標準化評估,已經被基本淘汰。目前流行的是第5代過繼細胞治療法,技術有2種,除了CAR-T細胞,還有一種叫TCR-T細胞。


              四、免疫評估


              ICIs制劑的療效主要和以下幾個因素相關:


              1. 新抗原數量:突變負荷是指正常等位基因(A)突變成有害等位基因(a)形成在選擇上不利的純合體(aa)所引起群體適應度下降的現象。如:人類的一些代謝遺傳病,象黑尿癥、半乳糖血癥等。


              用腫瘤突變負荷(TMB)來定量:被定義為每百萬堿基中被檢測出的,體細胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數。具體操作就是測量某種腫瘤體細胞內編碼蛋白的堿基突變數量,包括替換、插入/缺失等各種形式的突變;


              量化的描述TMB,可分為4類:

              1)TMB-High=>20mutations/Mb;

              2)TMB-Intermediate, 6-19 Muts/Mb;

              3) TMB-Low <= 5 Muts/Mb;


              體細胞突變可能受到外源性誘變因素的影響,比如肺癌中煙草(吸煙)誘導的C→A的突變。惡性黑色素瘤中,紫外線照射引起的C→T的突變。內源性因素引起的突變可以是DNA錯配修復突變,比如結直腸癌和食管癌中的MSI(微衛星不穩定)。在實體腫瘤中,95%的突變為單個堿基的替換,造成的非同義突變(一個核苷酸突變改變一個蛋白的氨基酸順序),錯義突變(非同義點突變,單個核苷酸改變導致一個密碼子編碼一個不同的氨基酸)和無義突變(非同義點突變使一個密碼子變為終止密碼子引起多肽鏈合成提前終止),共同構成了體細胞非同義突變的基本要素。


              2. TMB相關因素:腫瘤突變負荷(tumormutation burden,TMB)、微衛星高度不穩定(microsatellite instability-high, MSI-H)和錯配基因修復缺失(mismatch-repairdeficiency,MMR),這些潛在的bio-marker又指向一個共同點突變相關新抗原(mutation-associated neoantigen)。


              3. 腫瘤微環境種的PD-L1表達豐度及TIL數量。具體見荷蘭Christian U Blank在科學雜志撰文并畫出的影響抗癌免疫反應的7大因素雷達圖。


              4. 微生態:《科學》雜志發表的五篇腸道微生物影響腫瘤免疫治療的研究文章,來闡述免疫療法療效與腸道微生物的關系。


              2015年11月27日,《科學》雜志發表了兩篇研究,首次指出癌癥患者腸道微生物的組成,決定了以檢查點抑制劑(CTLA-4、PD-L1)為代表的癌癥免疫療法的有效性。由法國GustaveRoussy 癌癥中心的免疫學家Laurence Zivogel博士領導的研究小組發現,腸道中具有多形擬桿菌和脆弱類桿菌的小鼠,在接受CTLA-4抗體治療時,會表現出更好的治療效果;而無菌小鼠的腫瘤則對該治療幾乎沒有響應;在給無菌小鼠移植特定菌株后,可以增強CTLA-4抗體療法的有效性。來自芝加哥大學的Thomas Gajewski團隊,也通過類似的方法,證明了雙歧桿菌屬有利于PD-L1抑制劑的抗腫瘤效果。


              2017年11月2日,《科學》雜志再次同時在線發表了兩篇重磅論文。


              一篇《Gut microbiomeinfluences efficacy of PD-1–based immunotherapy against epithelial tumors》還是由兩年前的Laurence Zivogel博士團隊研究撰寫,這次的研究對象從老鼠轉移到了人類。該團隊對接受過PD-1抑制劑治療的249例癌癥患者進行了分析,其中69例患者因常規原因(如牙科治療或尿路感染),在接受PD-1治療前后服用了抗生素。那些服用抗生素的癌癥患者,因為抗生素導致腸道菌群紊亂,在接受PD-1抑制劑治療之后,癌癥很快就復發,總體生存期(OS)竟然比未服用抗生素的患者縮短了近45%!


              研究人員還將人類患者的腸道微生物移植到無菌小鼠身上,結果發現移植那些治療有效患者腸道微生物的小鼠,接受PD-1/L1抑制劑治療同樣會有效,而移植無效患者的腸道微生物,治療也就無效。具體試驗過程如下:


              ①分析249名患肺癌、腎癌等腫瘤并接受抗PD-1免疫抑制劑治療的患者,69名同時接受廣譜抗生素(ATB);

              ②ATB患者平均總生存期為8.3個月,遠遠低于非ATB患者的15.3個月;

              ③患者體內Akkermansia muciniphila(Akk菌)的相對豐度與對免疫檢查點抑制劑(ICI)的響應顯著相關;

              ④將對ICI響應的患者的糞菌移植給無菌小鼠,可以改善PD-1抑制劑對小鼠腫瘤的效果;

              ⑤移植對ICI不響應的患者糞菌的無菌小鼠,在口服Akk菌后,也能恢復對PD-1抑制劑的響應。 


              同時刊發的另一篇論文中,來自美國德克薩斯州大學安德森癌癥中心的研究人員,對112名接受PD-1抑制劑治療的癌癥患者進行了口腔和腸道微生物的分析。結果發現免疫療法有效與無效患者的腸道菌群存在顯著差異,證實腸道微生物在免疫療法中扮演了極其關鍵角色。


              2018年1月5日,ThomasGajewski團隊登頂《科學》封面,腸道微生物影響人類癌癥患者免疫治療效果再次得到證實!研究人員通過對42名轉移性黑色素瘤患者的糞菌構成進行分析,結果證明患者腸道菌群與PD-1免疫療法的效果之間存在顯著關聯,并在對治療響應明顯的患者腸道菌群中,鑒定出高豐度的長雙歧桿菌、產氣柯林斯菌和屎腸球菌,并發現在給無菌小鼠移植這些人類患者的腸道微生物后,能夠顯著增強小鼠的腫瘤免疫應答和腫瘤控制。


              有人會問,為什么不同的研究團隊鑒定出的菌群種類不完全一致,North Carolina大學Scott Bultman教授表示:“研究對象所處地理位置和飲食習慣不同,腸道菌群不同是正常的,而且不同研究之間也存在一定的重合度?!?/span>


              另外一些因素:

              療效好的:吸煙、近期放療

              療效差的:EGFR基因突變。


              KRAS突變,似乎不影響療效:總體人群的臨床獲益率為29%,攜帶KRAS突變的患者臨床獲益率是36%,兩者無統計學差異。關于這一點,要做一下額外的補充:事實上,KRAS突變的非小細胞肺癌可以分為三類。

              (1)同時攜帶KRAS和P53突變的患者,這類患者對PD-1治療敏感;

              (2)同時攜帶KRAS和STK11突變的患者,這類患者對PD-1治療抵抗;

              (3)其他患者,對PD-1治療的有效率居中。


              在本次研究中,①攜帶STK11突變的患者,接受PD-1抑制劑治療,的確是有效率更差的;②JAK突變、B2M突變的患者,要當心,③PD-L1表達和TMB高低無關④MDM2、MDM4擴增的患者,是否會發生超進展,有待進一步研究。


              五、毒性管理與療效評價


              細胞因子釋放綜合癥(Cytokine Release Syndrome, CRS):


              在CAR-T細胞治療過程中發生的一種過度免疫反應。臨床表現主要包括:發熱;特征性細胞因子升高;和臨床毒性的存在(表1)。并發CRS患者的典型發燒,通常在回輸CAR-T細胞后約24小時開始并且可以持續數天。然而,發燒并不總能夠預示臨床發生相關毒性的多少,嚴重程度和發病趨勢。


              至少7個細胞因子水平在血清中的增高與患者發生CRS具有明確的相關性,這些細胞因子是:IFN-γ (干擾素-γ),Fracktalkine (分形趨化因子),GM-CSF (粒-巨噬細胞生長因子),IL-5(白細胞介素-5),IL-6(白細胞介素-6),Flt-3L (人FMS樣酪氨酸激酶3配體)和IL-10 (白細胞介素-10)。


              7種細胞因子在需要治療的重癥CRS患者中,至少有2項比治療前基線水平增高75倍。重癥CRS患者都出現了至少一個下述臨床表現:缺氧,低血壓,和/或神經系統的異常改變。


              因此,結合臨床和實驗室數據,可以根據以下3項指標來確診患者CRS的發生:

              1. 持續發燒超過3天(~38C°);

              2. 選擇性細胞因子升高;

              3.伴有臨床毒性反應的證據。


              上述標準可以將患者分為重癥CRS組和非CRS組。非CRS組患者包括未發生CRS患者,也包括僅有低熱和輕度細胞因子增高的輕度CRS患者。重癥CRS患者需要密切觀察和治療干預。非CRS患者僅需要常規觀察和一般性對癥處理。重癥CRS患者平均住院時間為56.7天(SD=28.6;范圍20-104天)。非CRS患者平均住院15.1天(SD=18.8;范圍:4-61天)。


              盡管在CAR-T治療引起的嚴重副作用發生之前,檢測血清CRS相關細胞因子,可以指導臨床診斷和治療,但是每天快速實時檢測細胞因子,因技術上的限制并不現實可行。研究發現,血清急性反應蛋白之一,C-反應蛋白(CRP)水平的增減與CRS時患者血清IL-6水平和IL-6受體阻滯劑治療后顯著相關。同樣C-反應蛋白水平與類固醇藥物對CRS的療效顯示了明顯的負相關。因此認為C-反應蛋白是預測CRS的一個良好指標。C-反應蛋白水平超過正常閾值預示具有CRS發生的高度危險性,C-反應蛋白測定的敏感性約86%,而特異性為100%。 


              細胞因子釋放綜合癥的處理


              重癥CRS產生的不良反應和毒性作用需要有效和強力的醫療干預。通常包括血管活性升壓藥支持,呼吸機支持,使用抗癲癇藥和解熱鎮痛藥物。盡管這些毒副作用令人擔心,迄今為止,在正確有效的醫療處理條件下,臨床上CRS已經是完全可逆性的。


              采用大劑量類固醇激素相當于每天100mg以上強的松劑量,可以迅速逆轉CRS的臨床癥狀。然而,問題的另一方面是,類固醇藥物也能抑制CAR-T的體內增殖,使得使用類固醇類藥物治療CRS的患者,有較高的復發率,影響CAR-T治療的療效。


              白細胞介素-6受體(IL-6R)阻斷性單克隆抗體藥物(Tocilizumab)也可以用來治療和改善CRS的毒副作用。已有臨床試驗證明,阻斷IL-6受體后能迅速解決CRS帶來的毒副作用。在3例CRS患者中(患者血清中IL-6濃度增高達正常濃度的27-400倍),單獨使用Tocilizumab抗體后,患者發燒和CRS癥狀在1-3日內明顯緩解,療效與類固醇療法相似,外周血檢測顯示Tocilizumab治療對CAR-T細胞體內增殖沒有影響。


              CAR-T治療能引起對神經系統的毒性作用?;颊呖赡艹霈F可逆性神經系統并發癥。包括神志不清和癲癇樣癥狀?;颊呖梢园l生漸進性的神志混亂,詞語困難,失語,可最終發展到反應遲鈍。有些患者的神經系統并發癥發展到需要氣管插管及機械輔助通氣等措施,以便對呼吸道加以保護。對神經系統并發癥的檢查,CT和磁共振成像常無特別發現。腦電圖能確診癲癇樣腦電波活動,有助于指導抗癲癇治療的處理。


              ICIs治療相關毒性管理:


              針對細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxicT lymphocyte-associated antigen 4, CTLA4)和程序性死亡受體(programmed death-1 receptor,PD-1)及其配體PD-L1的單克隆抗體(monoclonalantibodies,MoAbs)治療已經成為越來越多腫瘤的標準治療。越來越多的患者應用這些藥物的同時也可能會出現治療相關的毒性。毒性發生率在不同的免疫檢查點抑制藥物之間也不盡相同。


              免疫檢查點抑制劑(immunecheckpoint inhibitors,ICPi)的毒性可以分為輸注反應和免疫相關不良事件(immune-related adverse events,irAE)或特殊關注的不良事件(adverseevents of special interest,AEoSI)。ESMO臨床實踐指南僅涉及后者。雖然某些臟器的irAE更加常見,但實際任何器官和組織都有可能受累。最常發生的irAE主要累及皮膚、結腸、內分泌器官、肝臟和肺;其他組織和器官雖然少見,但有可能相對更嚴重、甚至是致命的,比如神經系統病變和心肌炎。


              Ipilimumab的免疫相關毒性

              Ipilimumab,一種抗CTLA4單抗,臨床劑量為3mg/kg時,60%~85%的人群出現irAE:大多數是1~2級毒性,約10%~27%的人會發生3~4級毒性,在早期的3期臨床研究中有2.1%的患者出現ipilimumab相關的死亡。這些毒性發生的時間各不相同,但大多出現在治療開始后的8~12周[圖中列出了ipilimumab治療后不良事件(adverseevents,AE)的發生時間],皮膚毒性常為首發癥狀。這些毒性特征表現為劑量依賴性:ipilimumab劑量為0.3 mg/kg時并沒有觀察到3~4級的不良事件,而使用10mg/kg時,3~4級毒性上升到30%。當ipilimumab 10 mg/kg繼以維持劑量作為輔助治療時,3~4級irAE的發生率為41.6%,5級irAE的發生率為1.1%。對于1-2級的皮膚AE,繼續應用(至少1周)ICPi。如果出現瘙癢,則開始應用外用潤膚劑、抗組胺藥和/或糖皮質激素(低強度)乳膏。當AE≤1級時重新開始應用ICPi。對于3級的皮膚AE,暫停ICPi,并立即應用外用潤膚劑、抗組胺藥和高強度的糖皮質激素乳膏[II, B]。對于4級的皮膚AE,停用ICPi(永久),考慮收患者入院,并立即與皮膚科醫生會診。開始應用經靜脈給藥的糖皮質激素[1–2 mg/kg(甲基)強的松],并根據AE的緩解情況逐漸減量[II, B]。


              療效評價

              目前的試驗結果發現腫瘤微環境中PD-L1和淋巴細胞雙陽性的病人在黑色素瘤中有45%,肺癌中有17%, 膀胱癌中有32%,這個比例和臨床試驗抗PD-1/PD-L1治療的反應率很相似。


              2009年國際上建議并制定腫瘤免疫治療的療效判斷新標準—免疫相關反應標準(Immune-RelatedResponse Criteria,irRC),以彌補RECIST或改良后的WHO標準并不完全適用于抗腫瘤細胞免疫治療的缺陷。


              六、ICIs耐藥現象的解釋


              為何有些腫瘤抵抗PD-1/PD-L1治療,陳列平教授將耐藥性腫瘤分為3類: 

              ① Target-missingresistance:這些腫瘤不表達PD-L1,或者有PD-L1但沒有T淋巴細胞(缺乏PD-1),因此屬于靶子缺失型。這種腫瘤對PD-1/PD-L1抗體治療不可能有效果。明顯有其他逃逸機制在起作用。 

              ② Primaryresistance:腫瘤微環境中有PD-L1,也有T細胞,但病人對PD-1/PD-L1抗體治療沒有反應。 這樣的情況比較少見。

              ③ Acquiredresistance:腫瘤微環境中有PD-L1,也有T細胞。病人對PD-1/PD-L1抗體治療最初也有反應,但是后來腫瘤復發,用PD-1/PD-L1抗體再治療也無效。這一種才是真正的耐藥。


              MD安德森的Padmanee Sharma發表文章《Primary, Adaptive, andAcquired Resistance to Cancer Immunotherapy》討論ICIs的耐藥機制。


              腫瘤免疫療法的一個顯著特點是腫瘤響應的時間長,但是在使用anti-CTLA-4或anti-PD-1治療黑色素瘤的患者中,大約有1/4-1/3的患者在經歷初始響應后出現了腫瘤進展,即獲得性耐藥。獲得性耐藥的產生的主要是腫瘤細胞上特定基因或通路的表達或上調,從而導致腫瘤微環境中免疫細胞的浸潤以及功能受到抑制。例如,T細胞功能的喪失,腫瘤抗原提呈出現缺陷以及其他一些新突變的產生。例如,在一類較晚獲得anti-PD-1耐藥性的病人中,發現了B2M的突變,從而導致抗原提呈機制缺陷。在另兩例獲得性耐藥腫瘤中,發現了IFNγ通路中JAK1或JAK2發生了突變。PD-1抗體只是解除了“T細胞枷鎖”,疾病的控制最終還是要通過T細胞實現,因此,凡是影響T細胞招募、激活等功能的,均能夠最終影響PD-1抗體的臨床收益。


              導致免疫療法耐藥的腫瘤內在原因:


              ①MAPK通路的激活與或PTEN表達的缺失而引起的PI3K通路的增強:

              癌基因信號通過MAPK通路導致VEGF與IL-8的產生,從而抑制T細胞的招募與功能。腫瘤抑制基因PTEN表達缺失從而PI3K通路增強,這與IFNγ,顆粒酶B的基因表達量降低以及腫瘤浸潤CD8+T細胞的數目減少是高度相關的。


              ②WNT/β-catenin信號通路的持續表達:

              癌基因信號通過穩定β-catenin導致WNT信號通路持續激活,從而將T細胞排除在腫瘤之外。在人Non-T-cell-inflamed的黑色素瘤中,腫瘤內在的β-catenin信號基因高度表達,且在腫瘤微環境中缺少T細胞與CD103+DC細胞。


              ③腫瘤上PD-L1的高表達:

              腫瘤上高表達的某些配體如PD-L1,會抑制抗腫瘤T細胞的應答。多種機制可能導致PD-L1高表達,包括PTEN的缺失或PI3K/AKT的突變,EGFR突變,MYC過表達,CDK5基因破壞以及PD-L1基因3’-UTR的截短。目前還不知道PD-L1的高表達是否會對anti-PD-1/PD-L1的響應有影響,但是它會影響其他的腫瘤免疫療法。

              IFNγ信號通路的缺失:由腫瘤特異的T細胞產生的IFNγ,能夠識別腫瘤細胞或抗原遞呈細胞上的相應受體,從而發揮有效的抗腫瘤免疫響應。IFNγ能夠增強MHC分子的表達,從而增強腫瘤抗原提呈作用。IFNγ也能夠招募其他的免疫細胞,或者直接抑制腫瘤細胞的增殖,促進其凋亡。因此腫瘤細胞上IFNγ通路相關蛋白,如IFNγ受體IFNGR1與IFNGR2,IFNγ受體鏈JAK1與JAK2,STATs,IRF1等突變與缺失,都會導致對免疫檢查點抑制劑的耐藥。


              ④缺少腫瘤抗原:

              免疫療法依賴于腫瘤抗原特異的T細胞。在人黑色素瘤,腎細胞癌,非小細胞肺癌中,DNA突變頻率高,腫瘤免疫原性更強,因而對anti-PD-1療法響應更好。而在胰腺癌以及前列腺癌中,DNA突變頻率低,腫瘤免疫原性低,對anti-PD-1療法響應差。


              ⑤抗原提呈機制存在缺陷:

              在某些情況下,由于抗原加工過程中的蛋白酶體成員,轉運蛋白,MHC本身以及beta-2-微球蛋白(B2M)的功能缺陷,會導致抗原提呈機制不能有效地將腫瘤抗原提呈到細胞表面。B2M在HLAI家族的折疊與轉運到細胞膜的過程中發揮關鍵作用,若其喪失功能,則CD8+T細胞失去了識別功能。


              ⑥存在一系列特定基因的表達:

              在對PD-1療法沒有響應的腫瘤中,有一些基因表達被富集,被稱為innate anti-PD-1 resistance signature,或IPRES。這些基因與間葉細胞的轉化,全能型以及傷口愈合相關,且更傾向于表達在胰腺癌等對PD-1不響應的腫瘤中。


              導致原發性/繼發性耐藥的腫瘤外部原因:


              這些原因是由于腫瘤微環境中一些成員發揮抗癌免疫響應的抑制作用,主要包括調節T細胞Tregs,髓樣抑制細胞MDSCs,M2巨噬細胞,其他的抑制性免疫檢查點與抑制性細胞因子等。


              ① Tregs:

              Tregs能通過分泌抑制性細胞因子或者通過直接的細胞接觸來抑制效應T細胞Teffs的響應。許多人腫瘤中發現了浸潤的Tregs,且鼠模型中去除腫瘤微環境中的Tregs能夠顯著提高免疫響應。由于CTLA-4在Tregs上高表達,anti-CTLA-4能夠顯著提高Teffs/Tregs的比例,從而提高腫瘤對免疫療法的響應。


              ② Myeloid-derivedsuppressor cells (MDSCs):

              MDSCs在多種病理條件包括腫瘤,發揮著免疫響應調節因子的作用。人MDSCs表達CD11b+與CD33+,但是不表達HLA-DR以及系種特異的抗原CD3,CD19與CD57。MDSCs能夠促進血管生長,腫瘤侵襲與轉移。腫瘤微環境中MDSCs的存在與降低的生存率以及免疫檢查點抑制劑療法的響應率相關。目前實驗中使用PI3Kγ抑制劑來調節巨噬細胞功能,在老鼠模型中,PI3Kγ抑制劑與anti-PD-1聯用表現出了良好的腫瘤抑制效果。


              ③ M2macrophages:

              腫瘤相關的巨噬細胞(Tumor-Associated Macrophages,TAMs)也能夠影響免疫治療的響應。TAMs包括M1巨噬細胞和M2巨噬細胞,在大多數情況下M2巨噬細胞占TAMs的大多數。其中M1巨噬細胞能夠高表達IL-12,IL-23,MHC以及B7家族分子來促進抗原提呈與Th1細胞的激活,從而發揮抗腫瘤免疫作用;而M2巨噬細胞能夠分泌抑制性細胞因子IL-10與TGF-β,從而抑制免疫響應與促進腫瘤生長與轉移。臨床上TAMs的數目越多,腫瘤預后就越差。臨床前實驗使用巨噬細胞集落刺激生長因子受體1(CSF-1R)的抑制劑,能夠顯著減少TAMs數目,抑制腫瘤生長。CSF-1R抑制劑與anti-CTLA4或anti-PD1再加上吉西他濱聯用,能夠有效緩解單獨anti-CTLA-4或anti-PD1不響應的鼠胰腺癌模型。


              ④ 其他的抑制性免疫檢查點:

              除了PD-1與CLTA-4,T細胞上還存在其他的抑制性免疫檢查點,包括TIM-3,LAG-3,BTLA,TIGIT,和VISTA等。2016年《naturecommunication》上,有研究者發現anti-PD-1耐藥性的產生與抑制性免疫檢查點TIM-3的的表達量升高密切相關。在兩個老鼠腫瘤模型中,耐藥后與給藥前相比,腫瘤浸潤的T細胞而非外周血或脾臟T細胞上的TIM-3表達量顯著上調,且TIM-3表達量上調的主要是那些結合了anti-PD-1抗體的T細胞。需注意的是TIM-3表達量升高是anti-PD-1療法特異的,因為anti-CTLA-4中并未檢測到類似現象。此外,腫瘤細胞上TIM-3配體Galectin-9的表達量也顯著升高。當anti-PD-1療法出現耐藥后,聯用anti-TIM-3,顯著提高了生存率。有意思的是,當anti-PD-1和anti-TIM-3聯用被耐藥,腫瘤重新進展時,那些結合了anti-PD-1和anti-TIM-3抗體的T細胞上,其他的抑制性免疫檢查點如CTLA-4,LAG-3的表達量明顯升高。這說明了腫瘤浸潤T細胞的抑制性免疫調節是動態變化的,存在著補償效應。最后,在兩例對anti-PD-1療法獲得性耐藥的NSCLC病人腫瘤樣本中,也觀察到了TIM-3而非其他抑制性免疫檢查點的表達量顯著升高。這些結果說明了anti-PD-1和anti-TIM-3聯用是對于那些anti-PD-1療法獲得性耐藥病人的一個良好策略。


              免疫抑制細胞因子與免疫抑制分子:


              腫瘤或者巨噬細胞會釋放一些免疫抑制細胞因子或者免疫抑制分子來減弱局部的抗腫瘤免疫反應。腫瘤微環境中的免疫因子或免疫細胞的異常表達


              某些免疫因子如激活型免疫因子(IL-12,IL-23),抑制性免疫因子(IL-10與TGF-β),免疫細胞如Tregs, Myeloid-derivedsuppressor cells 等能夠顯著影響抗體的臨床治療效果。TGF-β能夠促進血管生成,刺激Tregs從而發揮免疫抑制作用。在多種腫瘤中,高水平的TGF-β都伴隨著極差的預后。臨床前實驗使用TGF-β受體激酶抑制劑與anti-CTLA-4聯用,或者放療與TGF-β抑制劑都顯示出了較好的腫瘤抑制效果。在細胞外,CD39能夠將ATP水解成AMP,進一步被胞外核苷酶CD73加工為免疫抑制分子腺苷adenosine。Adenosine能夠通過T細胞上的A2A受體抑制T細胞的增殖與細胞毒活性,也能通過腫瘤細胞上的A2B受體促進腫瘤轉移。多種類型的腫瘤中,CD73的高表達伴隨著較差的預后,且會影響anti-PD-1的效果。此外,IFNγ會促進免疫抑制分子IDO的表達,IDO能直接負調控效應T細胞的功能。


              趨化因子與趨化因子受體:


              某些特異的趨化因子與趨化因子受體在MDSCs和Tregs往腫瘤微環境的運輸過程中起到重要作用。腫瘤細胞能夠分泌配體CCL5,CCL7和CXCL8,通過結合MDSCs上表達的CCR1及CXCR2受體,從而將MDSCs吸引至腫瘤微環境中。CCR4在Tregs上高表達,anti-CCR4能夠有效抑制T細胞的招募并通過ADCC效應減少Tregs的數目。此外CXCR4是CXCL12的受體,CXCL12能夠通過影響Tregs定位等多種方式發揮免疫抑制作用。


              腫瘤浸潤細胞上CD28的表達:


              CD28是T細胞的共刺激分子,對于T細胞的激活,增殖和存活起到關鍵作用。在人出生時,所有T細胞都會表達CD28,但是CD28的表達量會隨著年齡的增加而下降,80歲時會有10-15%的CD4+T細胞以及50-60%的CD8+ T細胞缺失CD28表達。CD28-T細胞產生的主要原因是重復的抗原刺激。CD28表達的消失只存在與人和靈長動物中,在鼠中并沒有被發現。


              2017年03月09號,science期刊發表了來自Emory疫苗中心的研究工作,他們發現CD28對于耗盡的CD8+T細胞(ExhaustedCD8+ T Cell)的再激活是必須的。在老鼠模型中,阻斷CD28-B7共刺激通路,會影響腫瘤特異CD8+T細胞的增殖和激活,降低對anti-PD-1/PD-L1療法的響應。在經過anti-PD-1治療的NSCLC病人中,增殖的CD8+T細胞(高Ki-67表達)大都為PD-1陽性,且被激活(高HLA-DR,CD38表達)。和鼠模型中一樣,這些增殖的CD8+T細胞大都是CD28陽性的,說明了CD28共刺激對于腫瘤浸潤的PD-1+CD8+T細胞的增殖與再激活是至關重要的。因此,CD28可以用作預測anti-PD-1療法響應程度的分子標記。


              抗體藥物失效的可能原因是巨噬細胞“吃掉”了它:


              MGH研究人員將PD-1抗體opdivo、腫瘤細胞、T細胞、巨噬細胞等分別染色,發現PD-1抗體能夠與巨噬細胞表面的Fcγ受體結合,從而被巨噬細胞“吃掉”,這在體外細胞實驗和小鼠體內均得到證實,同時研究人員發現酶PNGaseF能過抑制該吞噬過程,這給PD-1抗體臨床治療方案的優化提供思路。


              ICIs抗體藥物耐藥對策:

              ①聯合用藥:多個免疫檢查點抑制劑藥物的聯合使用(opdivo聯合yerovy)。

              ②抗體藥物和化療藥物的聯合使用:如keytruda+培美曲塞+卡鉑聯合治療方案。

              ③在生物標志物的指導下采取個性化治療方案,以獲得更高的臨床收益。


              七、臨床應用


              人類對癌癥的認知經歷了細胞與分子生物學水平的演進,目前對癌的解釋可以概括為:自身體細胞在基因組突變積累的基礎上出現失控增殖表型和遷移失控表型并可能表達異常信號分子,通過占位效應和分子毒性效應導致原宿主多細胞系統代謝奔潰的生命現象。


              這種現象見于各種動物,但不同物種發病率不同,在人類60歲以后癌癥是常見致死致殘性疾病,如果一個人活到80歲有50%可能性出現癌癥類現象,癌癥的異質性很大,有些即使很大也未必致死,有些即使轉移也能較長時間存活。


              人類在癌癥免疫療法取得突破性進展之前主要的局部治療有:外科式手術刀或者物理化學消融性微創外科、放射線治療、化學藥物、分子靶向藥物(各種抗體或者小分子酪氨酸激酶抑制劑)。


              當前比較成功的抗癌免疫治療方法是CART-T過繼免疫治療和免疫檢測點抑制劑。前者在血液腫瘤取得了很大的成功,后者在血液腫瘤及實體腫瘤均顯示了療效。傳統的抗癌療法與免疫治療具有協同效應,而且傳統的抗癌療法也對免疫系統或免疫反應有一定影響:


              ① 化療藥物吉西他濱、卡培他濱及環磷酰胺在破壞癌細胞的同時釋放的癌細胞壞死物比其它化療或分子靶向內分泌藥物更具有抗原性。


              ② 物理如放射線或者物理化學消融如熱冷及酒精等消融技術殺死的癌細胞裂解物也具有一定免疫原性,甚至可導致殘余腫瘤消退。


              ③ 外科大手術創傷大具有免疫抑制效應,切除過程中的癌細胞破碎可導致癌細胞脫落轉移,當然也可能會導致免疫原性反應。


              未來的方向是:

              ①了解原發和繼發耐藥的機制。

              原發耐藥:微環境中缺乏靶點,或者存在另外的免疫抑制機制。

              繼發耐藥:TME發展出一些針對ICIs的新機制,如直接吞噬抗體。


              ②了解TME免疫抑制的整體框架。



              現在看來,在癌癥病灶中肯定存在著一種類似保護罩似的局部結構,我覺得可以從以下幾方面理解:


              ③闡明轉移癌細胞離開腫瘤微環境為啥可以存活的機制。理解轉移前和轉移后微環境的免疫學性質變化。


              癌細胞離開創始根據地去宿主的其它地盤上開疆拓土是一件風險極大的事情。進入血液中的癌細胞存活下來的機率非常低,多數被殺死或者自己死亡。能夠粘附血管壁并進入周圍組織存活下來的又低了許多。不過有證據表明,即使血液中可以檢測到存活癌細胞,但最終的解決有以下幾種:


              ④闡明構建癌癥免疫和代謝之間的關系。

              代謝是生命的基本特征,所有有生命系統的根本特征。本質上所有的生命都是由基本粒子組成的,基本粒子組成了原子,原子組成了分子,這種不斷的系統化后使得系統有了超級復雜性和有序性。為了維持超級系統,系統必須要代謝物質并攝入能量。


              免疫是廣義的代謝概念的一種,代謝包含了免疫機能在內。多細胞化后的動物代謝負荷加大,為了供應所有的細胞盡可能獲得營養物質,多細胞體系特化了循環系統;為了提高攝食效率,發展了運動系統;為了協調運動系統和內在運動系統循環系統的效率,發展了神經系統。神經系統是一種高級精準的協調系統,后來居上地位于內分泌和免疫系統之上,免疫系統是消化系統的補充系統。內分泌系統負責各功能細胞群的遠距離近距離通訊,媒介為化學分子。


              ⑤闡明癌癥免疫與細胞行為調控的關系。

              人體細胞在過去的35億年里一直在變化,直至成為今天的細胞形態與功能之前它經歷了復雜的演化過程。最近6億年的演化過程中,人體細胞的祖先是一個開放的系統,接受一切有利于自己的整合。人類基因組中的基因規模目前尚不是很清楚,推測由3萬條基因單位。這些基因是長時間和地球外界自然環境相互作用的結果,經歷了殘酷的自然選擇過程和對外界的同化過程,才建立起了今天的規模。人類基因組呈現豐富的多態性,既與演化的分支有關,如6萬年前就與歐洲人分開的亞洲人與歐洲人之間存在顯著的表型差異;也與外界環境有關,如病毒基因組序列對人類基因組的轉染與整合,外界自然有利有害突變的積累,以及生活方式和生殖方式對現有基因組體系構建的影響。


              免疫系統的基本架構早在單細胞階段就已構建了起來。例如免疫球蛋白的結構在人體內是一個巨大的家族,包括了細胞上的受體(TCR)、MHC等,根據FC段的不同又分類為5種免疫球蛋白。到了多細胞階段后,免疫系統已經分化為一個龐雜巨大的網絡系統,雖然經常出錯:如不能完全遏制由于人類基因組不穩定性帶來的異常增殖性突變,本來細胞的增殖是統一于宏觀的神經內分泌調控的。這種增殖可能會伴有移動性病灶擴散,即所謂的惡性增殖、毒性增殖。


              題外話:物理學視角下人生演化過程


              基本粒子的費米特性,泡利不相容原理,使得原子組成的世界按照層次的原則組建了起來,出現了多層次的生物進化。每個生物個體都是一個宇宙在重演的宇宙的歷史,個體人也不例外。多細胞動物人雖然看起來很復雜,其實基本的構成不外代謝與免疫2個,還有一個是與其共生的微生態。


              代謝是外在的免疫,免疫是內在的代謝;代謝的本質是同化,免疫的本質是清除。


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