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              乘干細胞之東風——火爆“外泌體”的崛起


              來源:干細胞者說


              隨著間充質干細胞(MSCs)培養技術的推廣,外泌體作為高科技概念產品迅速風靡細胞治療和藥妝行業。當然,你聽到的這些應用只是外泌體應用的冰山之一角。

              今天我們就來聊一聊外泌體這個時髦的名詞。

              風靡市場的外泌體相關產品

              其實,說起外泌體也是鼎鼎大名的,可以說也是諾獎級的。2013年的諾貝爾生理學或醫學獎授予美國科學家詹姆斯·羅思曼、蘭迪·謝克曼以及德國科學家托馬斯·祖德霍夫,以表彰他們發現細胞的囊泡運輸調控機制。外泌體就是囊泡的其中一種。

              一句話概括就是:外泌體就是一部貨拉拉,裝了自家一堆亂七八糟的東西(里面有miRNA,mRNAlncRNA,還有細胞因子,或許還有點DNA),然后分泌出細胞外,再接著進入另一個細胞,卸車完事。

               

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              外泌體是何方神圣?

              外泌體(exosome)是一類直徑30-150nm,具有完整膜結構的細胞外囊泡,主要負責細胞間的物質運輸和信息傳遞。

              1983年,外泌體首次于綿羊網織紅細胞中被發現, 1987年,Johnstone將其命名為"exosome"。起源于細胞內吞過程中形成的內體,最后再從細胞中釋放到胞外。

              作為細胞間的一種通訊方式,多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體,例如細胞培養液、血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體,經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中 。

              外泌體的電鏡照片

              外泌體的電鏡是鑒定外泌體形態大小的一個常規手段,電鏡下呈典型的杯狀形態。細胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs)是機體遠距離細胞間交流的一種手段。目前主要被分為3大類:外泌體、微囊泡和凋亡小體,臨床研究中主要關注的是外泌體。外泌體(直徑30~150nm,富含RNA和蛋白質),再大的就屬于微囊泡(直徑100~350nm,富含金屬蛋白酶和磷脂酰絲氨酸),再大就是凋亡小體(500~1000nm,富含組蛋白)了,由細胞凋亡產生。

              外泌體、微泡、凋亡小體三姐妹

               

               

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              外泌體的生物學效應和分離方法

              外泌體發揮生物學效應的方式有哪里呢?主要有以下兩種:

              1直接作用。外泌體表面的蛋白分子或脂質配體直接激活靶細胞表面的受體,產生信號復合體并激活胞內信號通路;

              2遞送作用。外泌體可以與靶細胞的質膜融合或內吞直接進入細胞,將自身攜帶的蛋白質、核酸、脂質等活性分子帶到細胞內,進而調控細胞的功能及生物學行為。

              外泌體發揮生物學效應的方式(以MSCs為例)

              超速離心法是分離外泌體的標準方法。在4℃條件下依次以300G,2000G,10000G的轉速離心,依次去除細胞和細胞碎片等,再以100000G超速離心得到外泌體。但離心法每次處理的樣本量較小,而且反復高速離心會導致外泌體破裂影響質量??筛鶕饷隗w密度使用連續梯度蔗糖密度梯度離心法,蔗糖對細胞無毒,粘度不高且pH中性,所獲外泌體純度高,但含有難以去除的高密度化學物,不適合臨床應用。超濾法用孔徑小于100nm的超濾膜短時間低速離心就可以分離得到外泌體,但超濾時施加的壓力比較大,導致體積大的囊泡變形和破裂。

              超速離心法分離外泌體

              我們也可通過CD63等外泌體特異性蛋白的抗體精準分離。另外,基于聚乙二醇(PEG6000)等聚合物沉淀的方法也被用于分離外泌體。也有研究人員將微流控技術和聲學巧妙結合形成聲流體裝置,首先,利用較低頻率(19.6 MHz)聲波去除血液中尺寸較大的紅細胞、白細胞以及血小板等;然后采用較高頻率(39.4 MHz)的聲波將外泌體與細胞外囊泡亞組成分(凋亡小體、較大的細胞外囊泡等)進行分離,并在通道的指定出口對外泌體進行收集。

               

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              外泌體用于組織修復再生

              由外泌體介導的遞送具有以下幾個優點:1、具有高度生物相容性,如果它們來自適當的細胞(例如間充質干細胞(MSCs)或未成熟的DC),則同時具備免疫惰性;2、能夠穿越人體厚實的組織屏障,如血腦屏障(BBB)等。正常情況下,外泌體可以直接用作和免疫調節的潛在治療劑。

              雖然說,干細胞外泌體成為研究熱點可能得益于干細胞研究的蓬勃發展,但干細胞外泌體確實有諸多優勢。

              *免疫原性低。外泌體比細胞具有更低的免疫原性。更容易地開發“貨架”產品。

              *易保存。外泌體在-20°C下儲存6個月,-80°C長期保存,同時不會損失其生化活性。

              *穩定。外泌體可保護其內容物免于降解,從而防止某些活性成分快速降解。

              *可量產。外泌體可在培養基內大量富集。

              *可控制。外泌體功能可通過改變細胞環境來改變。

              MSCs外泌體具有免疫調節、抗炎和抗纖維化、抑制氧化應激、增強血管生成等作用。這主要依賴于其中的蛋白和核酸組分。例如MSCs外泌體富含糖酵解相關酶,可增加ATP的產生,減少組織細胞死亡。MSCs外泌體還含有VEGF、TGF-β1、IL-6、IL-10HGF等細胞因子,有利于血管生成和免疫調節。20184月,FDA批準了Aegle公司的首個細胞外囊泡新藥(IND)申請,以開始用于燒傷患者的臨床試驗。該公司通過分離純化MSCs分泌的細胞外囊泡,用以治療嚴重的皮膚病,包括燒傷和大皰性表皮松解癥。

              外泌體可以促進皮膚創面愈合:促進創面局部巨噬細胞從促炎M1向抑炎M2型轉變從而有助于組織修復,抑制肌成纖維細胞分化和過度纖維化,從而減少瘢痕形成。有研究表明,人脂肪干細胞(ADSCs)來源的外泌體,含有豐富的miRNA-125AmiRNA-31,可顯著促進血管生成。而人羊膜上皮細胞來源外泌體,通過刺激基質金屬蛋白酶1MMP1)的表達來調控細胞外基質沉積,從而促進創面愈合。MSCs外泌體,也可用于調控系統紅斑狼瘡所致的骨質疏松的BMSCs功能,增加骨密度促進骨再生。

              外泌體中的miRNA,可以調控基因表達,其比例比細胞更高,例如miR-155、let-7f、miR-199a、miR-221、miR-125b-5pmiR-22等等,參與多種生理和病理過程。例如外泌體釋放的miR-125b-5p就有助于改善心肌梗死區功能。

               

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              外泌體用于腫瘤診斷和治療

              腫瘤細胞的外泌體,含有大量與腫瘤相關的核酸和蛋白,在癌癥發生和早期檢測中具有重要的研究和應用價值。例如通過使用49種抗體來檢測來自431位肺癌患者和150位健康個體的外泌體蛋白發現,與健康個體相比,CD171CD151在患者中高度表達,而外泌體CD151可作為檢測小細胞肺癌的標志物。

              外泌體內容物作為腫瘤的潛在診斷標志物(數據來源:中華檢驗醫學雜志)

              寄生蟲也可以,通過分泌外泌體將生物活性物質轉移到宿主細胞中,調控宿主免疫,介導寄生蟲的免疫逃逸。例如瘧原蟲、錐蟲、血吸蟲和弓形蟲等均可以通過外泌體影響宿主免疫。

              樹突細胞外泌體,可激活腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞反應并抑制體內腫瘤生長,有關樹突細胞外泌體應用的多種臨床試驗的開展,顯示出其作為治療方法應用的巨大潛力,但樹突細胞外泌體表面PD-L1過表達限制其療效,而基于樹突細胞外泌體聯合療法如與PD-1/PD-L1中和抗體的聯合應用,為樹突細胞外泌體抗腫瘤治療提供了新路徑。

               

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              如何看待外泌體的成藥性

              由于外泌體具有體積小、容易穿過細胞膜和免疫原性低等優點,可以作為藥物的良好載體。外泌體結構較穩定,可以應對不良理化環境。

              基于外泌體開發和應用的部分企業(圖:干細胞者說制)

              目前,許多基于外泌體的I/II期臨床試驗正在進行。不同來源的外泌體,在體內顯示不同的歸巢能力,這可能是與其膜表面受體和細胞外基質結合蛋白有關。靜脈注射是基于外泌體遞送藥物中使用最為廣泛的給藥途徑。腹腔注射、瘤內注射、口服和鼻腔給藥也在多種疾病模型中得到了嘗試。靜脈注射外泌體24h后,肝臟中熒光信號最強,其次是脾臟、胃腸道和肺部。

              因此,外泌體注射后的分布,以及長期的影響和安全性,仍將需要進一步探索和闡明。

              外泌體載藥可以分為三種:外源性載藥、內源性載藥和轉基因。

              外源性載藥方式:先分離外泌體,再將藥物通過轉染或電穿孔導入外泌體;

              內源性載藥方式:先將藥物導入細胞中,當藥物進入外泌體且從供體細胞中釋放后,分離純化得到載藥外泌體;

              轉基因方式:通過轉基因的方式讓細胞自身表達,最終隨外泌體分泌至細胞外。

              外泌體規?;瘧瞄_發關鍵在于兩點:一是依賴于細胞培養條件的提升,3D培養是一個方向。二是依賴于外泌體分離純化方法的提升,濾膜分離是一個方向。哺乳動物細胞釋放的外泌體較少,產量不高,可依次通過10μm、5μm1μm的聚碳酸酯膜擠出外泌體-模擬納米囊泡,通過富集,產量比天然外泌體高出100倍以上,產量高且易于純化,為外泌體規?;瘧糜谂R床提供了可能。

              近幾年,關于外泌體的研究文章數量呈井噴式發展,無論是提取制備工藝還是作為一種治療制劑和藥物,或者作為疾病的新型診斷標志物,都有了長足的發展。外泌體有希望成為人們通向健康大門的橋梁。

              參考文獻(部分)

              1.Exosomes: composition, biogenesis and function." Nat Rev Immunol 2(8): 569-579.2002

              2.Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol 200(4): 373-383.2013

              3.Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities." Nat Rev Drug Discov 12(5): 347-357.2013

              4.Human umbilical cord mesenchymal stem cells and exosomes: bioactive ways of tissue injury repair[J].Am J Transl Res. 11(3): 1230–1240.2019; 

               

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